ସମ୍ବାଦ

Nature.com ପରିଦର୍ଶନ କରିଥିବାରୁ ଧନ୍ୟବାଦ |ଆପଣ ବ୍ୟବହାର କରୁଥିବା ବ୍ରାଉଜର୍ ସଂସ୍କରଣରେ ସୀମିତ CSS ସମର୍ଥନ ଅଛି |ସର୍ବୋତ୍ତମ ଅଭିଜ୍ଞତା ପାଇଁ, ଆମେ ପରାମର୍ଶ ଦେଉଛୁ ଯେ ଆପଣ ଏକ ଅପଡେଟ୍ ବ୍ରାଉଜର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ (କିମ୍ବା ଇଣ୍ଟରନେଟ୍ ଏକ୍ସପ୍ଲୋରରରେ ସୁସଙ୍ଗତତା ମୋଡ୍ ଅକ୍ଷମ କରନ୍ତୁ) |ମ meantime ିରେ ମ continued ିରେ, ନିରନ୍ତର ସମର୍ଥନ ନିଶ୍ଚିତ କରିବାକୁ, ଆମେ ଶ yles ଳୀ ଏବଂ ଜାଭାସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ବିନା ସାଇଟ୍ ଉପସ୍ଥାପନ କରିବୁ |
ସେଲ୍ୟୁଲାର୍ ଚାପକୁ ଦୂର କରିବା ଏବଂ ଅଗ୍ରଗତି ଜାରି ରଖିବା ପାଇଁ କର୍କଟ କୋଷଗୁଡ଼ିକ ବିଭିନ୍ନ ଯନ୍ତ୍ରକ ev ଶଳର ବିକାଶ କରିଛନ୍ତି |ପ୍ରୋଟିନ୍ କିନାସ୍ ଆର (PKR) ଏବଂ ଏହାର ପ୍ରୋଟିନ୍ ଆକ୍ଟିଭେଟର୍ (PACT) ହେଉଛି ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକାରୀ ଯାହା ବିଭିନ୍ନ ଚାପ ସଙ୍କେତ ଉପରେ ନଜର ରଖେ ଯାହା କୋଷ ବିସ୍ତାର ଏବଂ ଆପୋପ୍ଟୋସିସ୍ ପ୍ରତିରୋଧ କରିଥାଏ |ଅବଶ୍ୟ, କର୍କଟ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ PACT-PKR ରାସ୍ତାର ନିୟମାବଳୀ ପ୍ରାୟତ unknown ଅଜ୍ଞାତ ହୋଇ ରହିଥାଏ |ଏଠାରେ, ଆମେ ଜାଣିଲୁ ଯେ ଲମ୍ବା ଅଣ-କୋଡିଂ RNA (lncRNA) ଆସପାର୍ଟିଲ୍ tRNA ସିନ୍ଥେଟେଜ୍ ଆଣ୍ଟିସେନ୍ସ RNA 1 (DARS-AS1) PACT-PKR ରାସ୍ତାର ପ୍ରତିବନ୍ଧନରେ ସିଧାସଳଖ ଜଡିତ ଏବଂ କର୍କଟ କୋଷ ବିସ୍ତାରକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରେ |CRISPRi 971 କର୍କଟ ସମ୍ବନ୍ଧିତ lncRNA ର ବୃହତ ଆକାରର କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ସ୍କ୍ରିନିଂ ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ଜାଣିଲୁ ଯେ DARS-AS1 କର୍କଟ କୋଷ ବିସ୍ତାର ସହିତ ଜଡିତ |ତେଣୁ, DARS-AS1 ନକ୍ଆଉଟ୍ କୋଷ ବିସ୍ତାରକୁ ପ୍ରତିବନ୍ଧିତ କରେ ଏବଂ ଭିଟ୍ରୋରେ ବିଭିନ୍ନ କର୍କଟ ସେଲ୍ ଲାଇନରେ କର୍କଟ ସେଲ୍ ଆପୋପ୍ଟୋସିସକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରେ ଏବଂ ଭିଭୋରେ ଟ୍ୟୁମର ବୃଦ୍ଧିକୁ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ କରେ |ଯାନ୍ତ୍ରିକ ଭାବରେ, DARS-AS1 ସିଧାସଳଖ PACT ଆକ୍ଟିଭେସନ୍ ଡୋମେନ୍ ସହିତ ବାନ୍ଧିଥାଏ ଏବଂ PACT-PKR ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରିଥାଏ, ଯାହା ଦ୍ PK ାରା PKR ସକ୍ରିୟତା, eIF2α ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ ହ୍ରାସ ହୁଏ ଏବଂ ଆପୋପଟୋଟିକ୍ ସେଲ୍ ମୃତ୍ୟୁକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରିଥାଏ |ଚିକିତ୍ସାଳୟରେ, DARS-AS1 ଏକାଧିକ କର୍କଟରେ ବହୁଳ ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଥାଏ, ଏବଂ ଏହି lncRNA ର ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ ଏକ ଖରାପ ପୂର୍ବାନୁମାନର ସୂଚକ |ଏହି ଅଧ୍ୟୟନ DARS-AS1 lncRNA ଦ୍ P ାରା PACT-PKR ରାସ୍ତାର କର୍କଟ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ନିୟନ୍ତ୍ରଣକୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରେ ଏବଂ କର୍କଟ ରୋଗର ନିରାକରଣ ଏବଂ ଚିକିତ୍ସା ପାଇଁ ଅନ୍ୟ ଏକ ଲକ୍ଷ୍ୟ ପ୍ରଦାନ କରେ |
ଚାପ ସହିତ ଖାପ ଖୁଆଇବାର କ୍ଷମତା କର୍କଟ କୋଷର ବଞ୍ଚିବା ଏବଂ ବିସ୍ତାରର ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଗୁଣ |କଠିନ ମାଇକ୍ରୋ ପରିବେଶରେ କର୍କଟ ଶିଖରର ଦ୍ରୁତ ବିସ୍ତାର ଏବଂ ମେଟାବୋଲିକ୍ ହଲମାର୍କ - ପୁଷ୍ଟିକର ଅଭାବ, ହାଇପୋକ୍ସିଆ ଏବଂ କମ୍ pH - ଯାହା କୋଷ ମୃତ୍ୟୁ ସଙ୍କେତ ପଥକୁ ଟ୍ରିଗର କରିପାରେ |ଚାପ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ ଜିନ୍ଗୁଡ଼ିକର ବିଭାଜନ ଯେପରିକି p535, ଉତ୍ତାପ ଶକ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ 6, 7, KRAS8, 9, ଏବଂ HIF-110, 11, 12, 13 କର୍କଟ ରୋଗରେ ବାରମ୍ବାର ଦେଖାଯାଏ, ଯାହା ଦ୍ ap ାରା ଆପୋପ୍ଟୋସିସ୍ ରୋକାଯାଇ ବଞ୍ଚିଥାଏ।
ପ୍ରୋଟିନ୍ କିନାସ୍ ଆର (PKR) ହେଉଛି ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଚାପ ସେନ୍ସର ଏବଂ ଇଉକାରିଓଟିକ୍ ଇନିସିଏସନ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟର୍ 2α (eIF2α) ର ସବନିଟ୍ କିନାସ୍, ଏକ ଅନୁବାଦକାରୀ ନିୟନ୍ତ୍ରକ ଯାହା ସେଲ୍ୟୁଲାର୍ ଚାପକୁ କୋଷ ମୃତ୍ୟୁ ସହିତ ଯୋଡିଥାଏ |PKR ମୂଳତ an ଏକ ବିଦେଶୀ ଦ୍ୱିଗୁଣିତ RNA (dsRNA) ଚିହ୍ନଟ କରି ଏକ ଆଣ୍ଟିଭାଇରାଲ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିଲା |ସକ୍ରିୟ ହେବା ପରେ, ଭାଇରାଲ୍ ଏବଂ ସେଲୁଲାର୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସିନ୍ଥେସିସ୍ ପ୍ରତିରୋଧ କରିବା ପାଇଁ PKR ଫସଫୋରୀଲେଟ୍ eIF2α 14,15,16 |DsRNA17,18,19,20,21,22,23 ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ PACT (PKR ଆକ୍ଟିଭେଟର ପ୍ରୋଟିନ୍) ପ୍ରଥମ PKR ଆକ୍ଟିଭେଟର ପ୍ରୋଟିନ୍ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଛି |PKR ସହିତ ସିଧାସଳଖ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ମାଧ୍ୟମରେ, PACT ବିଭିନ୍ନ ଚାପ (ସେରମ୍ ଅନାହାର, ପେରକ୍ସାଇଡ୍ କିମ୍ବା ଆର୍ସେନାଇଟ୍ ଚିକିତ୍ସା) କୁ PKR ଏବଂ ଡାଉନ୍ଷ୍ଟ୍ରିମ୍ ସିଗନାଲ୍ ପଥରେ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରେ |EIF2α ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ ସହିତ, PACT- ମଧ୍ୟସ୍ଥ PKR ଆକ୍ଟିଭେସନ୍ ଚାପର ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ସହିତ ଜଡିତ ବିଭିନ୍ନ ଘଟଣାଗୁଡ଼ିକୁ ଟ୍ରିଗର କରିଥାଏ, PI3K / Akt24 ପାଥୱେ ମାଧ୍ୟମରେ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ରେଡକ୍ସ ସ୍ଥିତିକୁ, p5325,26 ଏବଂ NF-κB27,28 ମାଧ୍ୟମରେ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିଥାଏ | ଚାପର ପ୍ରତିକ୍ରିୟା, ବିସ୍ତାର, ଆପୋପ୍ଟୋସିସ୍ ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ପ୍ରମୁଖ ସେଲୁଲାର୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ସେମାନଙ୍କର ଗୁରୁତ୍ role ପୂର୍ଣ ଭୂମିକାକୁ ଦୃଷ୍ଟିରେ ରଖି PKR ଏବଂ PACT ଅନେକ ରୋଗ, ବିଶେଷକରି କର୍କଟ 30,31,32,33 ପାଇଁ ଚିକିତ୍ସା ଲକ୍ଷ୍ୟ ପ୍ରତିଜ୍ଞା କରୁଛନ୍ତି |ଅବଶ୍ୟ, ଏହି ପ୍ଲିଓଟ୍ରୋପିକ୍ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଏବଂ ଜ ological ବିକ ମହତ୍ତ୍ Despite ସତ୍ତ୍ cancer େ, କର୍କଟ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ PACT / PKR କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର ନିୟମାବଳୀ ଅବହେଳିତ ରହିଥାଏ |
lncRNA ଗୁଡ଼ିକ ହେଉଛି 200 ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ଠାରୁ ଅଧିକ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍, କ protein ଣସି ପ୍ରୋଟିନ୍-କୋଡିଂ ସମ୍ଭାବନା ନାହିଁ |ଯେହେତୁ ଅତ୍ୟାଧୁନିକ ପୁରା ଜିନୋମ୍ ସିକ୍ୱେନ୍ସିଂ ପ୍ରୋଜେକ୍ଟଗୁଡିକ ହଜାରେ lncRNA ଚିହ୍ନଟ କରିଛନ୍ତି, ସେମାନଙ୍କ ଜ ological ବିକ କାର୍ଯ୍ୟଗୁଡ଼ିକୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରିବା ପାଇଁ 35,36 ବହୁ ପ୍ରୟାସ କରାଯାଇଛି |ଅନୁସନ୍ଧାନର ଏକ ବ growing ୁଥିବା ସଂସ୍ଥା ଦର୍ଶାଇଛି ଯେ lncRNA ଗୁଡ଼ିକ ଅନେକ ଜ ological ବ ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ଜଡିତ ଅଛନ୍ତି 37, X- କ୍ରୋମୋଜୋମ ନିଷ୍କ୍ରିୟକରଣ 38,39, ଇମ୍ପ୍ରିଣ୍ଟିଂ 40, ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ 41,42, ଅନୁବାଦ 43 ଏବଂ ଏପରିକି କର୍କଟ ବୃଦ୍ଧି 44,45,46,47 |ଏହି ଅଧ୍ୟୟନଗୁଡିକ ରିପୋର୍ଟ କରିଛି ଯେ ଅନେକ lncRNA ଗୁଡିକ PACT / PKR ପଥରେ ଜଡିତ |ଏହିପରି ଏକ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ lncRNA ASPACT PACT ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ କୁ ପ୍ରତିବନ୍ଧିତ କଲା ଏବଂ PACT mRNA ର ଆଣବିକ ଧାରଣକୁ ବ increased ାଇଲା |ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ଅଧ୍ୟୟନରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ lncRNA nc886 PKR ସହିତ ବାନ୍ଧିଥାଏ ଏବଂ ଏହାର ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ 49,50 କୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରିଥାଏ |ଏପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ, lncRNA PACT- ମଧ୍ୟସ୍ଥ PKR ଆକ୍ଟିଭେସନ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରୁଥିବା ରିପୋର୍ଟ ହୋଇନାହିଁ |
ଆସ୍ପାର୍ଟାଇଲ୍-ଟିଆରଏନ୍ଏ ସିନ୍ଥେଟେଜ୍ ଆଣ୍ଟିସେନ୍ସ RNA 1 (DARS-AS1) ଏକ ଅଙ୍କୋଜେନିକ୍ lncRNA51,52,53,54 ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଛି |MiP-194-5p53, miP-12952 ଏବଂ miP-532-3p51 ର ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ମାଧ୍ୟମରେ, DARS-AS1 ଯଥାକ୍ରମେ ସ୍ୱଚ୍ଛ କୋଷ ବୃକକ୍ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା, ଥାଇରଏଡ୍ କାରସିନୋମା ଏବଂ ଅଣ-ଛୋଟ କୋଷ ଫୁସଫୁସ କାରସିନୋମା ବୃଦ୍ଧିକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିବାକୁ ଦର୍ଶାଯାଇଛି |ଟୋଙ୍ଗ ଏବଂ ସହକର୍ମୀମାନେ ମଧ୍ୟ ଜାଣିବାକୁ ପାଇଲେ ଯେ DARS-AS1 ପ୍ରୋଟିନ୍ 39 (RBM39) RNA- ବାନ୍ଧିବା ମୋଟିଫ୍ ର ସ୍ଥିରତା ବଜାୟ ରଖି ମାଇଲୋମା ପ୍ରଗତିକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରେ |ଅବଶ୍ୟ, ଏହି lncRNA PACT-PKR ସକ୍ରିୟକରଣ ଏବଂ କର୍କଟ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଚାପ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ଜଡିତ କି ନାହିଁ ସେ ସମ୍ବନ୍ଧରେ କ studies ଣସି ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଇ ନାହିଁ |
ଏଠାରେ, ଆମେ CRISPRi ସିଷ୍ଟମ ବ୍ୟବହାର କରି ଏକ ବୃହତ-ପରିମାଣର ଫଙ୍କସନ୍ ସ୍କ୍ରିନ୍ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିଥିଲୁ ଏବଂ ସ୍ଥିର କରିଥିଲୁ ଯେ DARS-AS1 lncRNA ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରକାରର କର୍କଟ କୋଷର ବିସ୍ତାରକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରେ |ଏହା ସହିତ, ଆମେ ଏକ ପ୍ରମୁଖ ଯନ୍ତ୍ରକ identified ଶଳ ଚିହ୍ନଟ କରିଛୁ: DARS-AS1 ସିଧାସଳଖ PACT ସହିତ ବାନ୍ଧେ, PACT ଏବଂ PKR ବନ୍ଧନକୁ ପ୍ରତିବନ୍ଧିତ କରେ, eIF2α ର ଫସଫୋରୀଲେସନକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରେ, ଏକ ନିମ୍ନ PKR ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍, ଏବଂ ଶେଷରେ ଆପୋପ୍ଟୋଟିକ୍ କୋଷ ମୃତ୍ୟୁକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରେ |ପରିଶେଷରେ, ଆମର କାର୍ଯ୍ୟ DARS-AS1 lncRNA କୁ PACT-PKR ପଥର ନିୟନ୍ତ୍ରକ ଏବଂ କର୍କଟ ଚିକିତ୍ସା ଏବଂ ପୂର୍ବାନୁମାନ ପାଇଁ ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରେ |
ବ୍ୟାପକ ଜେନୋମିକ୍ ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ଅଧ୍ୟୟନ କର୍କଟ ସହିତ ଜଡିତ ଶହ ଶହ lncRNA ଚିହ୍ନଟ କରିଛି |ତଥାପି, ସେମାନଙ୍କର କାର୍ଯ୍ୟ ପ୍ରାୟତ unknown ଅଜ୍ଞାତ ହୋଇ ରହିଥାଏ |କର୍କଟ ପ୍ରଗତିରେ ଜଡିତ ପ୍ରତିଜ୍ଞାକାରୀ lncRNA ପ୍ରାର୍ଥୀଙ୍କୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବାକୁ, ଆମେ CRISPRi ସିଷ୍ଟମ୍ (ଚିତ୍ର 1a) ବ୍ୟବହାର କରି SW620 କଲୋରେକ୍ଟାଲ୍ କର୍କଟ ସେଲ୍ ଲାଇନରେ ବିସ୍ତାର ହ୍ରାସ ପାଇଁ ଫଙ୍କସନ୍ ସ୍କ୍ରିନ୍ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିଥିଲୁ |SW480 ଏବଂ SW620 କୋଲୋନ୍ କର୍କଟ ସେଲ୍ ରେଖାଗୁଡ଼ିକର ଅନନ୍ୟ ବ is ଶିଷ୍ଟ୍ୟ ହେଉଛି ଯେ ସେମାନେ ଗୋଟିଏ ରୋଗୀର ପ୍ରାଥମିକ ଏବଂ ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଟ୍ୟୁମରରୁ ଉତ୍ପନ୍ନ |ଉନ୍ନତ କୋଲୋନ୍ କ୍ୟାନସରର ପ୍ରଗତିରେ ଜେନେଟିକ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଅଧ୍ୟୟନ ପାଇଁ ଏହା ଏକ ମୂଲ୍ୟବାନ ତୁଳନା ପ୍ରଦାନ କରେ |ତେଣୁ, ଆମେ RNA ସିକ୍ୱେନ୍ସିଂ ବ୍ୟବହାର କରି କଲୋରେକ୍ଟାଲ୍ କର୍କଟ ସେଲ୍ ରେଖା (SW480 ଏବଂ SW620) ର ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଟୋମ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରି ପ୍ରକାଶିତ ସାହିତ୍ୟରୁ କିଛି ସମ୍ଭାବ୍ୟ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ lncRNA ସଂଗ୍ରହ କରିଥିଲୁ |ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ଉପରେ ଆଧାର କରି, ଆମେ ଏକ ପୁଲ୍ଡ୍ sgRNA ଲାଇବ୍ରେରୀ ଡିଜାଇନ୍ କରି 7355 sgRNA ଅଲିଗୋସ୍ ଧାରଣ କରି 971 କର୍କଟ ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ lncRNA ଏବଂ 500 ନକାରାତ୍ମକ ଲକ୍ଷ୍ୟ ପାଇଁ 500 ଲକ୍ଷ୍ୟହୀନ sgRNA ଅଲିଗୋକୁ ଧାରଣ କରିଥିଲୁ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡାଟା 1) |
CRISPRi ସିଷ୍ଟମ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ସ୍କ୍ରିନିଂର ସ୍କିମେଟିକ୍ ଉପସ୍ଥାପନା |ସ୍କ୍ରିନିଂ ପରେ b sgRNA ସମୃଦ୍ଧ |ଭୂସମାନ୍ତର ବିନ୍ଦୁ ରେଖା log2 (ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ) = ± 0.58 କୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ |ଭୂଲମ୍ବ ବିନ୍ଦୁ ରେଖା p ମୂଲ୍ୟ = 0.05 କୁ ସୂଚିତ କରେ |କଳା ବିନ୍ଦୁଗୁଡ଼ିକ ଲକ୍ଷ୍ୟହୀନ sgRNA କୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍। କରେ (ଏନସି ଭାବରେ ନିଯୁକ୍ତ) |ଲାଲ୍ ବିନ୍ଦୁଗୁଡ଼ିକ ହେଉଛି DARS-AS1 କୁ ଟାର୍ଗେଟ୍ କରୁଥିବା sgRNA |ନୀଳ ବିନ୍ଦୁଗୁଡ଼ିକ ହେଉଛି LINC00205 କୁ ଟାର୍ଗେଟ କରୁଥିବା sgRNA, ଯାହା ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ଅଙ୍କୋଜେନିକ୍ lncRNA |ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ = (ସ୍ ized ାଭାବିକ ପଠନ, ଦିନ 17) / (ସାଧାରଣ ପ reading ଼ିବା, ଦିନ 0) |c DARS-AS1 sgRNA ନକଡାଉନ୍ କୋଷ ବୃଦ୍ଧିକୁ ପ୍ରତିବନ୍ଧିତ କଲା |ତ୍ରୁଟି ଦଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକ ତିନୋଟି ପରୀକ୍ଷଣର ମାନକ ବିଘ୍ନକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ |* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ପରୀକ୍ଷା |d ଟ୍ୟୁମରରେ DARS-AS1 ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି (TCGA ଡାଟାସେଟ୍) |em BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, ଏବଂ COAD ରୋଗୀଙ୍କ ଠାରୁ ଯୋଡି ହୋଇଥିବା ସାଧାରଣ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର୍ ନମୁନାରେ DARS-AS1 ର ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ଯଥାକ୍ରମେ (TCGA ଡାଟାସେଟ୍) |ଯୁକ୍ତ ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ଟେଷ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି p- ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ପ୍ରାପ୍ତ ହେଲା |
ପ୍ଲାସିମ ନିର୍ମାଣ ଏବଂ ଲେଣ୍ଟିଭାଇରସ୍ ପ୍ୟାକେଜ୍ କରିବା ପରେ, ଆମେ ଚାରିଟି ସ୍ independent ାଧୀନ ସଂକ୍ରମଣ ପରୀକ୍ଷଣରେ ଉପରୋକ୍ତ ଲାଇବ୍ରେରୀ ସହିତ dCas9-SW620 କଲୋରେକ୍ଟାଲ୍ କର୍କଟ ସେଲ୍ ଲାଇନକୁ ଟ୍ରାନ୍ସଡୁକ୍ କରିଦେଲୁ |ଏହି ସଂକ୍ରମଣ ପାଇଁ ସଂକ୍ରମଣର ବହୁଗୁଣ (MOI) 0.1–0.3 ଥିଲା, ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ ପ୍ରତ୍ୟେକ କୋଷକୁ କେବଳ ଗୋଟିଏ sgRNA ଦ୍ୱାରା ସଂକ୍ରମଣ କରାଯାଇପାରିବ |ଭିଟ୍ରୋ ସଂସ୍କୃତିର 18 ଦିନ ପରେ, ସ୍କ୍ରିନିଂ ପରେ ଟାର୍ଗେଟ୍ sgRNA ଗୁଡ଼ିକର ସମୃଦ୍ଧ ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ହ୍ରାସ ପାଇଲା କିମ୍ବା ବ increased ଼ିଲା, ପ୍ରି-ସ୍କ୍ରିନିଂ ପ୍ରୋଫାଇଲ୍ ତୁଳନାରେ ଅଣ-ଟାର୍ଗେଟେଡ୍ କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ ଅଲିଗ୍ନୁକ୍ଲାଏଟାଇଡ୍ ସଂଖ୍ୟା ଅପେକ୍ଷାକୃତ ଅପରିବର୍ତ୍ତିତ ରହିଲା, ଯାହା ଦର୍ଶାଏ ଯେ ଆମର ଲକ୍ଷ୍ୟର ଏକ ସ୍କ୍ରିନ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଅଛି | ଲାଇବ୍ରେରୀ |ଚାଉଳ |1 ବି ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଟେବୁଲ୍ 1) | LINC00205, ଯାହା ପୂର୍ବରୁ ଫୁସଫୁସ କର୍କଟ ଏବଂ ଯକୃତ କର୍କଟ ପ୍ରଗତି 588,59,60 କୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିବା ପାଇଁ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା, ସ୍କ୍ରିନିଂ କରାଯାଇଥିଲା (ଲଗ 2 (ଫୋଲଡଚେଞ୍ଜ) <−0.58, p ମୂଲ୍ୟ <0.05), ଏହି ସ୍କ୍ରିନିଙ୍ଗର ନିର୍ଭରଯୋଗ୍ୟତାକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରି (ଚିତ୍ର 1 ବି) | LINC00205, ଯାହା ପୂର୍ବରୁ ଫୁସଫୁସ କର୍କଟ ଏବଂ ଯକୃତ କର୍କଟ ପ୍ରଗତି 588,59,60 କୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିବା ପାଇଁ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା, ସ୍କ୍ରିନିଂ କରାଯାଇଥିଲା (ଲଗ 2 (ଫୋଲଡଚେଞ୍ଜ) <−0.58, p ମୂଲ୍ୟ <0.05), ଏହି ସ୍କ୍ରିନିଙ୍ଗର ନିର୍ଭରଯୋଗ୍ୟତାକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରି (ଚିତ୍ର 1 ବି) | LINC00 205 । 1 ବି) LINC00205, ପୂର୍ବରୁ ଫୁସଫୁସ କର୍କଟ ଏବଂ ଯକୃତ କର୍କଟ ରୋଗର ପ୍ରଗତିକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିବା ପାଇଁ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା 588,59,60, ଏହି ସ୍କ୍ରିନିଂର ଦୃ ust ତାକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରି (log2 (ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ) <-0.58, p- ମୂଲ୍ୟ <0.05) ବାଦ ଦିଆଯାଇଛି (ଚିତ୍ର .1 ବି) । LINC00205 之前 被 报道 进展 进展 5 58,59,60 ， 被 （（log2 （倍数） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 了 0.05 b b b b b b b LINC00205 之前 被 报道 进展 进展 5 58,59,60 ， 被 （（log2 （倍数） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 了 0.05 b b b b b b b LINC00 205 । 1 ବି) LINC00205, ପୂର୍ବରୁ ଫୁସଫୁସ ଏବଂ ଯକୃତ କର୍କଟ ପ୍ରଗତିକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିବାକୁ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା 5889, 60, ଏହି ସ୍କ୍ରିନିଙ୍ଗର ଦୃ ust ତାକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରି (log2 (ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନ) <-0.58, p- ମୂଲ୍ୟ <0.05) ବାଦ ଦିଆଯାଇଥିଲା |
ପରୀକ୍ଷିତ ସମସ୍ତ lncRNA ଗୁଡ଼ିକ ମଧ୍ୟରେ, DARS-AS1 ମଧ୍ୟ ସ୍କ୍ରିନ କରାଯାଇଥିଲା, ତିନିଟି କଗ୍ନେଟ୍ sgRNA ଅଲିଗ୍ନୁକ୍ଲାଏଟାଇଡ୍ 18 ଦିନର ସଂସ୍କୃତି ପରେ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ ପାଇଲା, ଏହି lncRNA ର ନକଡାଉନ୍ ଦ୍ cancer ାରା କର୍କଟ ବିସ୍ତାର ହ୍ରାସ ପାଇଲା (ଚିତ୍ର 1 ବି) |କଲୋରେକ୍ଟାଲ୍ କର୍କଟ କୋଷରେ MTS ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦ୍ This ାରା ଏହି ଫଳାଫଳକୁ ଅଧିକ ସମର୍ଥନ କରାଯାଇଥିଲା ଯେ ଦର୍ଶାଉଛି ଯେ DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଅଭିବୃଦ୍ଧି ହାର କେବଳ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କୋଷଗୁଡ଼ିକ ତୁଳନାରେ ଅଧା ହୋଇଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ କର୍କଟ ପ୍ରକାରର ପୂର୍ବ ରିପୋର୍ଟଗୁଡିକ ସହିତ ସମାନ ଥିଲା |: ସେଲ୍ କିଡନୀ କର୍କଟ, ଥାଇରଏଡ୍ କର୍କଟ ଏବଂ ଅଣ-ଛୋଟ କୋଷ ଫୁସଫୁସ କର୍କଟ 51,52,53,55 ସଫା କରନ୍ତୁ |ଅବଶ୍ୟ, କଲୋରେକ୍ଟାଲ୍ କର୍କଟରେ ଏହାର କାର୍ଯ୍ୟ ଏବଂ ମଲିକୁଲାର ଯନ୍ତ୍ରଗୁଡ଼ିକ ଅନ୍ୱେଷଣ ହୋଇ ରହିଥାଏ |ତେଣୁ, ଆମେ ଅଧିକ ଅଧ୍ୟୟନ ପାଇଁ ଏହି lncRNA କୁ ବାଛିଲୁ |
ରୋଗୀମାନଙ୍କରେ DARS-AS1 ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ଅଧ୍ୟୟନ କରିବାକୁ, ଆମେ କର୍କଟ ଜେନୋମ ଆଟଲାସ୍ (TCGA) ପ୍ରକଳ୍ପରୁ 10,327 ଟ୍ୟୁମର ନମୁନାକୁ ବିସ୍ତୃତ ଭାବରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ |ଆମର ଫଳାଫଳ ଦର୍ଶାଏ ଯେ ବିଭିନ୍ନ ଟ୍ୟୁମରରେ ସୁସ୍ଥ କୋଷରେ DARS-AS1 ବହୁଳ ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଥାଏ ଏବଂ କୋଲନ୍ ଆଡେନୋକାର୍କିନୋମା (COAD), ବୃକକ୍ ସ୍ୱଚ୍ଛ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (KIRC), ଏବଂ ବୃକକ୍ ପପିଲାରୀ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (KIRP) ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ |।ବହୁତ କମ୍ (ଚିତ୍ର 1d ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1a, ଖ) | ଯୋଡି ହୋଇଥିବା ସୁସ୍ଥ / ଟ୍ୟୁମର ନମୁନାଗୁଡିକର ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦ୍ d ାରା ବ୍ଲାଡର ୟୁରୋଥେଲିଆଲ୍ କରସିନୋମା (BLCA), କିଡନୀ ବୃକକ୍ ସ୍ୱଚ୍ଛ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (KIRC), ପ୍ରୋଷ୍ଟେଟ୍ ଆଡେନୋକାର୍କିନୋମା (PRAD), ଫୁସଫୁସ୍ ସ୍କ୍ୱାମସ୍ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (LUSC) ର ଟ୍ୟୁମରରେ DARS-AS1 ର ଯଥେଷ୍ଟ ଅଧିକ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ପ୍ରମାଣିତ ହେଲା | , ଗର୍ଭାଶୟ କର୍ପସ ଏଣ୍ଡୋମେଟ୍ରିଆଲ୍ କରସିନୋମା (UCEC), ଫୁସଫୁସ ଆଡେନୋକାରସିନୋମା (LUAD), ଯକୃତ ହେପାଟୋସେଲୁଲାର କରସିନୋମା (LIHC), କିଡନୀ ବୃକକ୍ ପେପିଲାରୀ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (KIRP), ଏବଂ କୋଲନ୍ ଆଡେନୋକାର୍କିନୋମା (COAD) (p ମୂଲ୍ୟ <0.05) (ଚିତ୍ର 1e - m) | । ଯୋଡି ହୋଇଥିବା ସୁସ୍ଥ / ଟ୍ୟୁମର ନମୁନାଗୁଡିକର ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦ୍ d ାରା ବ୍ଲାଡର ୟୁରୋଥେଲିଆଲ୍ କରସିନୋମା (BLCA), କିଡନୀ ବୃକକ୍ ସ୍ୱଚ୍ଛ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (KIRC), ପ୍ରୋଷ୍ଟେଟ୍ ଆଡେନୋକାର୍କିନୋମା (PRAD), ଫୁସଫୁସ୍ ସ୍କ୍ୱାମସ୍ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (LUSC) ର ଟ୍ୟୁମରରେ DARS-AS1 ର ଯଥେଷ୍ଟ ଅଧିକ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ପ୍ରମାଣିତ ହେଲା | , ଗର୍ଭାଶୟ କର୍ପସ ଏଣ୍ଡୋମେଟ୍ରିଆଲ୍ କରସିନୋମା (UCEC), ଫୁସଫୁସ ଆଡେନୋକାରସିନୋମା (LUAD), ଯକୃତ ହେପାଟୋସେଲୁଲାର କରସିନୋମା (LIHC), କିଡନୀ ବୃକକ୍ ପେପିଲାରୀ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (KIRP), ଏବଂ କୋଲନ୍ ଆଡେନୋକାର୍କିନୋମା (COAD) (p ମୂଲ୍ୟ <0.05) (ଚିତ୍ର 1e - m) | ।ଯୋଡି ହୋଇଥିବା ସୁସ୍ଥ / ଟ୍ୟୁମର ନମୁନାଗୁଡିକର ବିଶ୍ଳେଷଣ ମଧ୍ୟ ବ୍ଲାଡର ୟୁରୋଥେଲିଆଲ୍ କରସିନୋମା (BLCA), ସ୍ୱଚ୍ଛ ସେଲ୍ ବୃକକ୍ ଏବଂ ବୃକକ୍ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (KIRC), ପ୍ରୋଷ୍ଟେଟ୍ ଆଡେନୋକାର୍କିନୋମା (PRAD), ଫୁସଫୁସ୍ ସ୍କ୍ୱାମସ୍ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (LUSC) ଟ୍ୟୁମରରେ DARS-AS1 ର ଉଚ୍ଚତର ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ନିଶ୍ଚିତ କରେ |। ମି) , କର୍ପସ ଗର୍ଭାଶୟର ଏଣ୍ଡୋମେଟ୍ରିଆଲ୍ କରସିନୋମା, ଫୁସଫୁସର ଆଡେନୋକାର୍କିନୋମା (LUAD), ଯକୃତର ହେପାଟୋସେଲୁଲାର୍ କରସିନୋମା (LIHC), ବୃକକ୍ ର ପେପିଲାରୀ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (KIRP) ଏବଂ କୋଲନ୍ ର ଆଡେନୋକାର୍କିନୋମା (p ମୂଲ୍ୟ < 0.05) (ଚିତ୍ର 1e– ମି) |AR 健康 / 肿瘤 样本 的 AR AR AR DARS-AS1 在 膀胱 尿路 上皮 B (BLCA) 、 肾 肾 K K (KIRC) UCEC） （EC EC LUAD） ， 肝 （LIHC） ， IR IR IR IR IR IR IR IR IR IR <0.05） （e 1e-m） |配对 健康 / 肿瘤 ars ars dars-os1 在 尿路 ars ars p p p p p p p p p p p p p p p p l癌 （kirp） （coad） （p 值 <0.05） （e 1e-m） |ସୁସ୍ଥ / ଟ୍ୟୁମର ଯୋଡି ହୋଇଥିବା ନମୁନାଗୁଡିକର ବିଶ୍ଳେଷଣ ବ୍ଲାଡର ୟୁରୋଥେଲିଆଲ୍ କରସିନୋମା (BLCA), ସ୍ୱଚ୍ଛ ସେଲ୍ ବୃକକ୍ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (KIRC), ପ୍ରୋଷ୍ଟେଟ୍ ଆଡେନୋକାର୍କିନୋମା (PRAD) ଏବଂ ଫୁସଫୁସ୍ ସ୍କ୍ୱାମସ୍ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (LUSC) ଟ୍ୟୁମରରେ DARS-AS1 ର ଭୂମିକାକୁ ଅଧିକ ସମର୍ଥନ କଲା |(k) -ମ) କର୍ପସ ଗର୍ଭାଶୟ କାରସିନୋମା (UCEC), ଫୁସଫୁସ ଆଡେନୋକାର୍କିନୋମା (LUAD), ହେପାଟୋସେଲୁଲାର କରସିନୋମା (LIHC), ବୃକକ୍ ପପିଲାରୀ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (KIRP), ଏବଂ କୋଲୋନ୍ ଆଡେନୋକାର୍କିନୋମା (COAD) (p ମୂଲ୍ୟ <0.05) (ଚିତ୍ର 1e -m) ରେ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି |ଏକାଠି ନିଆଗଲା, ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ DARS-AS1 ବିଭିନ୍ନ କର୍କଟରେ ବ୍ୟାପକ ଏବଂ ଉଚ୍ଚ ଭାବରେ ପ୍ରକାଶିତ |
କାରଣ DARS-AS1 ଏବଂ DARS (ଆଣ୍ଟିସେନ୍ସ ଷ୍ଟ୍ରାଣ୍ଡ୍ ଜିନ୍ ଏନକୋଡିଂ) ସମାନ ପ୍ରୋମୋଟର୍ ଅଂଶୀଦାର କରେ ଏବଂ ପରସ୍ପର ପାଖରେ ଅବସ୍ଥିତ, ଆମେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଭାବରେ DARS-AS1 କୁ ନକ୍-ଡାଉନ୍ କରିବା ପାଇଁ shRNA ଡିଜାଇନ୍ କରିଥିଲୁ କିନ୍ତୁ DARS ନୁହେଁ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2a, b ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଟେବୁଲ୍ 2) | ।SW620 ସହିତ, ଆମେ shRNA ନକ୍ଡାଉନ୍ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ସାରଣୀ 3) ର କାର୍ଯ୍ୟକାରିତା ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବା ପାଇଁ DARS-AS1 କୁ ଉଚ୍ଚ ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା ଅନ୍ୟ ତିନୋଟି ସେଲ୍ ଲାଇନ୍ ମଧ୍ୟ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ |ଆମର ଫଳାଫଳ ସୂଚାଇ ଦେଇଛି ଯେ ବିକଶିତ ହୋଇଥିବା ସମସ୍ତ ତିନୋଟି shRNA ଅତିକମରେ 80% DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ ଦକ୍ଷତା ହାସଲ କରିଛି ଯାହା DARS mRNA (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2c - f) ଉପରେ କମ୍ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ |ଏହା ସହିତ, ଆମେ ଜାଣିଲୁ ଯେ ଏହି shRNA ଗୁଡ଼ିକ ସହିତ DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ କଲୋରେକ୍ଟାଲ୍ କର୍କଟ ସେଲ୍ ଲାଇନ୍ SW620 (49.7%) ଏବଂ HCT116 (27.7%), ସ୍ତନ କର୍କଟ ସେଲ୍ ଲାଇନ୍ MBA-MD-231 (53.4%) ରେ କୋଷ ବୃଦ୍ଧିରେ ଯଥେଷ୍ଟ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ସୃଷ୍ଟି କରିଥିଲା ​​|) ଏବଂ HepG2 ହେପାଟୋମା ସେଲ୍ ଲାଇନ୍ (92.7% ହ୍ରାସ), ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ଅଣସଂରକ୍ଷିତ କ୍ଷେତ୍ର ଗଠନ କରିବାର କ୍ଷମତା (ହାରାହାରି ହ୍ରାସ ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% ଏବଂ ସେଲ୍ ଲାଇନ୍ ପ୍ରତି 75.7%) (ଚିତ୍ର 2a, b) |SW620 ରେ, କଲୋନୀ ଗଠନ ଅନୁସନ୍ଧାନର ଫଳାଫଳ ଆହୁରି ନିଶ୍ଚିତ କଲା ଯେ DARS-AS1 shRNA ହାରାହାରି 69.6% ହ୍ରାସ ସହିତ କୋଷ ବିସ୍ତାରକୁ ଯଥେଷ୍ଟ ପ୍ରତିବନ୍ଧିତ କଲା (ଚିତ୍ର 2c) |
SW620, HCT116, MBA-MD-231, ଏବଂ HepG2 କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ shRNA ଏବଂ DARS-AS1 shRNA ର କୋଷ ବିସ୍ତାର (କ) ଏବଂ ସ୍ପେରେଏଡ୍ ଗଠନ (ଖ) ଉପରେ ପ୍ରଭାବ |c SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ କଲୋନୀ ଗଠନ ଉପରେ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ shRNA ଏବଂ DARS-AS1 shRNA ର ପ୍ରଭାବ |ସେଲ୍ ବିସ୍ତାର (d), ସ୍ପେରେଏଡ୍ ଗଠନ (e), ଏବଂ SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକର କଲୋନୀ ଗଠନ (f) DARS-AS1 କୁ ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ କରେ |ପ୍ରଦର୍ଶିତ ତଥ୍ୟ ହେଉଛି ତିନୋଟି ପରୀକ୍ଷଣର ହାରାହାରି ± ମାନକ ବିଘ୍ନ |* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ଏବଂ *** p ≤ 0.001 ଦୁଇ ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ଟେଷ୍ଟ ଦ୍ୱାରା |
ଫଙ୍କସନ୍-ଫଙ୍କସନ୍ ଅଧ୍ୟୟନକୁ ପୂର୍ଣ୍ଣ କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ DARS-AS1 କୁ ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2g) ସୃଷ୍ଟି କରିଛୁ |DARS-AS1 ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ କୋଷ ବୃଦ୍ଧି (1.8 ଗୁଣା), ଅଣସଂରକ୍ଷିତ ସ୍ପେରେଏଡ୍ ଗଠନ (1.4 ଗୁଣା), ଏବଂ SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ କଲୋନୀ ଗଠନ (3.3 ଗୁଣା) ଯଥେଷ୍ଟ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା (ଚିତ୍ର 2d - f) |ଅନ୍ୟ ଏକ DARS-AS1 ସେଲ୍ ଲାଇନ୍, A549 ବ୍ୟବହାର କରି ଆମେ ଏହି ଫଳାଫଳକୁ ନିଶ୍ଚିତ କଲୁ |DARS-AS1 ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ ହେତୁ ଏହି ବର୍ଦ୍ଧିତ କୋଷ ବିସ୍ତାର A549 କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ଅଧିକ ଦେଖାଗଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2 ଘଣ୍ଟା, i ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ସାରଣୀ 3) |ଏକାଠି ନିଆଗଲା, ଏହି ଲାଭ ଏବଂ କ୍ଷତି ଅଧ୍ୟୟନଗୁଡିକ ଦର୍ଶାଏ ଯେ DARS-AS1 ଭିଟ୍ରୋରେ କର୍କଟ କୋଷ ବିସ୍ତାରକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରେ |
ଅନ୍ତର୍ନିହିତ ଯନ୍ତ୍ରକ explore ଶଳ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବାକୁ ଯାହା ଦ୍ D ାରା DARS-AS1 କୋଷ ବିସ୍ତାରକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରେ, ଆମେ ଏହାର ସମ୍ଭାବ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍-ବାନ୍ଧୀ ଅଂଶୀଦାରମାନଙ୍କୁ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ଏକ RNA ପଲ୍-ଡାଉନ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲୁ |RT-qPCR ଫଳାଫଳ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ DARS-AS1 ର ପ୍ରାୟ 86.2% SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକର ସାଇଟୋପ୍ଲାଜରେ ଅବସ୍ଥିତ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3a) |ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଡ୍ ବାୟୋଟିନାଇଟେଡ୍ DARS-AS1 କିମ୍ବା ସିଉଡୋଆର୍ଏନ୍ଏ ପରେ SW620 ସେଲ୍ ଲାଇସେଟ୍ ସହିତ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପରେ SDS-PAGE ପୃଥକତା |ପରବର୍ତ୍ତୀ ରୂପା ଦାଗ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ DARS-AS1 ଟାଣ ନମୁନାରେ ଏକ ଭିନ୍ନ ବ୍ୟାଣ୍ଡ (~ 38 kDa) ଯଥେଷ୍ଟ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲା କିନ୍ତୁ ଡମି RNA କିମ୍ବା ବିଡି ନମୁନାରେ ନୁହେଁ (ଚିତ୍ର 3a) |ଏହି ବ୍ୟାଣ୍ଡକୁ ଏକ PKR ସକ୍ରିୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ (PACT) ଭାବରେ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି (MS) ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ SW620, HCT116, ଏବଂ HepG2 ସେଲ୍ ରେଖା (ଚିତ୍ର 3a, b) ରେ ଇମ୍ୟୁନୋବ୍ଲୋଟିଂ ଦ୍ୱାରା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା |ପାଶ୍ଚାତ୍ୟ ବ୍ଲୋଟିଂ (ଡବ୍ଲୁବି) ଦ୍ୱାରା RNA ବିଶ୍ଳେଷଣ ବ୍ୟବହାର କରି DARS ଏବଂ ଆନୁଷଙ୍ଗିକ PACT ପ୍ରୋଟିନ୍ - PKR ଏବଂ TRBP ର ସମୃଦ୍ଧତା ମଧ୍ୟ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରାଯାଇଥିଲା |ଫଳାଫଳ ସୂଚାଇ ଦେଇଛି ଯେ DARS-AS1 RNA ଏବଂ ଏହି ତିନୋଟି ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଧ୍ୟରେ କ direct ଣସି ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ମିଳିଲା ନାହିଁ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3b) |DARS-AS1 ଏବଂ PACT ମଧ୍ୟରେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା RNA ଇମ୍ୟୁନୋପ୍ରାଇସିପାଇଟ୍ (RIP) ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦ୍ confirmed ାରା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ଦର୍ଶାଇଥିଲା ଯେ DARS-AS1 ଆଣ୍ଟି- PACT ଆଣ୍ଟିବଡିରେ ଯଥେଷ୍ଟ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲା କିନ୍ତୁ ଅନ୍ୟ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ RNA ନୁହେଁ (ଚିତ୍ର 3c) |ଅନ୍ୟ କ cell ଣସି ସେଲ୍ୟୁଲାର୍ ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକର ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ DARS-AS1 ସିଧାସଳଖ PACT ସହିତ ଯୋଗାଯୋଗ କରେ କି ନାହିଁ ତାହା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ, ଶୁଦ୍ଧ PACT ବ୍ୟବହାର କରି ଏକ ଭିଟ୍ରୋ ବାୟୋଲାୟର୍ ଇଣ୍ଟରଫେରୋମେଟ୍ରି (BLI) ଅନୁସନ୍ଧାନ କରାଯାଇଥିଲା |ବାୟୋଟିନ୍-ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା DARS-AS1 କିମ୍ବା ଡମି RNA ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ (SA) ବାୟୋସେନ୍ସର୍ ଉପରେ ଅସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତା’ପରେ 1 μM PACT ଧାରଣ କରିଥିବା ଗତିଜ ବଫର୍ରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ, PACT DARS-AS1 (KD ମୂଲ୍ୟ ~ 26.9 nM) ସହିତ ଦୃ strongly ଭାବରେ ବନ୍ଧା ହୋଇଛି, କିନ୍ତୁ RNA କୁ ଅନୁକରଣ କରିବା ପାଇଁ ନୁହେଁ (ଚିତ୍ର 3d) |ଏକାଠି ନିଆଗଲା, ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ DARS-AS1 ଏବଂ PACT ମଧ୍ୟରେ ଏକ ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଏବଂ ଉଚ୍ଚ ସମ୍ପର୍କକୁ ଦର୍ଶାଏ |
RNA ଟାଣ ବିଶ୍ଳେଷଣ SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ PACT ସହିତ ଯୋଗାଯୋଗ କରୁଥିବା DARS-AS1 ଚିହ୍ନଟ କଲା |ଉପରେ, ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ପ୍ରୋଟିନର ରୂପା ଦାଗ |ଲୋ-ଇମ୍ୟୁନୋବ୍ଲଟ୍ ଆଣ୍ଟି- PACT ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ କରାଯାଇଥିଲା |b RNA ଟାଣିବା ବିଶ୍ଳେଷଣ HCT116 (ଉପର) ଏବଂ HepG2 (ତଳ) କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ କରାଯାଇଥିଲା |ଇମ୍ୟୁନୋବ୍ଲୋଟିଂ ଦ୍ୱାରା PACT ସମୃଦ୍ଧତା ଚିହ୍ନଟ ହେଲା |ସୂଚିତ ଆଣ୍ଟିବଡି ବ୍ୟବହାର କରି SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ cRNA ପ୍ରତିରୋପଣ (RIP) ଅନୁଧ୍ୟାନ କରାଯାଇଥିଲା |d PACT ବାନ୍ଧିବା ବକ୍ରଗୁଡିକ ପୂର୍ଣ୍ଣ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ DARS-AS1 କିମ୍ବା ନିୟନ୍ତ୍ରଣ RNA ବାୟୋଲାୟର୍ ଇଣ୍ଟରଫେରୋମିଟ୍ରି (BLI) ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରାପ୍ତ ହେଲା |ଏକ ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡାଇନ୍ ବାୟୋସେନ୍ସର୍ ଉପରେ RNA ଅସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା |ଆସୋସିଏସନ ମାପିବା ପାଇଁ 1 μM PACT ବ୍ୟବହୃତ ହେଲା |ଇ RNA ଟାଣ ଆସେ ବାୟୋଟିନାଇଟେଡ୍ ପୂର୍ଣ୍ଣ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ DARS-AS1 କିମ୍ବା ଛୋଟ (ଉପର) ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା |PACT ଗ୍ରହଣ କରୁଥିବା ଇମ୍ୟୁନୋବ୍ଲୋଟ୍ (ତଳ) |f ଶୁଦ୍ଧ ଫ୍ଲାଗଡ୍ PACT ବାୟୋଟିନାଇଟେଡ୍ ପୂର୍ଣ୍ଣ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ DARS-AS1 ସହିତ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଯାଇଥିଲା କିମ୍ବା ଭିଟ୍ରୋ RIP ଅନୁଧ୍ୟାନ ପାଇଁ ଛୋଟ (ଇ ପରି) |ବାହାର କରାଯାଇଥିବା RNA RT-qPCR ଦ୍ୱାରା ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା |g PACT ପାଇଁ ବିଭିନ୍ନ RNA ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକର ଆପେକ୍ଷିକ ସମ୍ବନ୍ଧ ବାୟୋଲାୟର୍ ଇଣ୍ଟରଫେରୋମିଟ୍ରି ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରାପ୍ତ ହେଲା |ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, 100 nM RNA ଏବଂ 1 μM RAST ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |h ଭିଟ୍ରୋ RIP ଅନୁଧ୍ୟାନଗୁଡିକ ଶୁଦ୍ଧ ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣ କିମ୍ବା PACT ନାମକ ଲେବଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି କରାଯାଇଥିଲା |ବାହାର କରାଯାଇଥିବା RNA RT-qPCR ଦ୍ୱାରା ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା |i SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଅଭିବୃଦ୍ଧି ହାର DARS-AS1, PACT, କିମ୍ବା ଉଭୟକୁ ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ କରେ |j SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ପୂର୍ଣ୍ଣ ଦ length ର୍ଘ୍ୟ କିମ୍ବା ଛୋଟ DARS-AS1 ର ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ କୋଷ ବୃଦ୍ଧି ଉପରେ ଭିନ୍ନ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଲା |k ଆପୋପ୍ଟୋସିସ୍ ଆଣ୍ଟି- PARP ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଇମ୍ୟୁନୋବ୍ଲୋଟିଂ ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିଲା |l DARS-AS1 ର ନକ୍ଆଉଟ୍ ଫ୍ଲୋ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ଦ୍ୱାରା ଦେଖାଯାଇଥିବା ପରି SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଆପୋପ୍ଟୋସିସ୍ ସୃଷ୍ଟି କରେ |ପ୍ରଦର୍ଶିତ ତଥ୍ୟ ହେଉଛି ତିନୋଟି ପରୀକ୍ଷଣର ହାରାହାରି ± ମାନକ ବିଘ୍ନ | * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, **** p <0.0001, ଦୁଇ ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ପରୀକ୍ଷା ଦ୍ୱାରା | * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, **** p <0.0001, ଦୁଇ ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ପରୀକ୍ଷା ଦ୍ୱାରା | * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 по дву аононнему критерию Стьюдента। * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, **** p <0.0001 ଦୁଇ ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ଟେଷ୍ଟ ଦ୍ୱାରା | * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, **** p <0.0001 ， 通过 双 学生 学生 t。 * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, **** p <0.0001 ， 通过 双 学生 学生 t。 * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, **** p <0,0001 по дву аононнему критерию Стьюдента। * p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, **** p <0.0001 ଦୁଇ ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ଟେଷ୍ଟ ଦ୍ୱାରା |
ତାପରେ ଆମେ PACT ଆସୋସିଏସନ୍ (ଚିତ୍ର 3e) ପାଇଁ ଆବଶ୍ୟକ DARS-AS1 ଅଞ୍ଚଳକୁ ଚିହ୍ନିବା ପାଇଁ ଭିଟ୍ରୋ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଦ୍ୱାରା ତିନୋଟି ବାୟୋଟିନାଇଟେଡ୍ DARS-AS1 RNA ଖଣ୍ଡ ସୃଷ୍ଟି କରିଥିଲୁ |RNA ବିଶ୍ଳେଷଣ ଫଳାଫଳ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଖଣ୍ଡ PACT ସହିତ ଯୋଗାଯୋଗ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ହୋଇଥିଲା, କିନ୍ତୁ 3′-ଟର୍ମିନାଲ୍ ଅଞ୍ଚଳ (A4 ନାମକ 384–768 ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍) A1 ନାମକ 1–384 ରୁ ଅଧିକ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ ଦେଖାଇଲା (ଚିତ୍ର 3e) |ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ PACT (ଚିତ୍ର 3f) ବ୍ୟବହାର କରି ଭିଟ୍ରୋ RIP ଅନୁଧ୍ୟାନରେ ସମାନ ଫଳାଫଳ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଥିଲା |ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ସହିତ ସ୍ଥିର, BLI ବ୍ୟବହାର କରି PACT ରେ ଅସ୍ଥିର RNA ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକୁ ବାନ୍ଧିବା ପାଇଁ ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ ମଧ୍ୟ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ PACT ର A3 (384–768 nt) (KD ମୂଲ୍ୟ ପ୍ରାୟ 94.6 nM) ପାଇଁ ଅଧିକ ସମ୍ପର୍କ ଥିବାବେଳେ ଅନ୍ୟ କ୍ଷେତ୍ର ସହିତ ପ୍ରାୟ କ links ଣସି ଲିଙ୍କ୍ ନାହିଁ |(ଚିତ୍ର 3d)
ଆମେ ମଧ୍ୟ PACT ରେ ଜଡିତ ବାନ୍ଧୁଥିବା ଅଞ୍ଚଳଗୁଡିକ ପରୀକ୍ଷା କରିଛୁ |PACT ତିନୋଟି କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଡୋମେନ୍ ଧାରଣ କରେ, ସେଥିମଧ୍ୟରୁ ଦୁଇଟି ସଂରକ୍ଷିତ RNA- ବାଇଣ୍ଡିଂ ଡୋମେନ୍ (dsRBD) ଏବଂ ଏକ ତୃତୀୟ ଡୋମେନ୍ (ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ D3) ଯାହା ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର ସକ୍ରିୟକାରୀ ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରେ |ପ୍ରତ୍ୟେକ ଡୋମେନ୍ ର lncRNA ବନ୍ଧନ କ୍ଷମତାକୁ ପରୀକ୍ଷା କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ତିନୋଟି ମ୍ୟୁଟେସନ୍ ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ କଲୁ ଯାହା ତିନୋଟି ଡୋମେନ୍ ମଧ୍ୟରୁ ପ୍ରତ୍ୟେକକୁ ଅପସାରଣ କଲା ଏବଂ ଏକ ଭିଟ୍ରୋ RIP ଅନୁଧ୍ୟାନ କଲା |ଆମର ଫଳାଫଳ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ PACT ର ତୃତୀୟ ଡୋମେନ୍ (D3) ବିଲୋପ କରିବା ଦ୍ two ାରା ଅନ୍ୟ ଦୁଇଟି ପରିବର୍ତ୍ତନ (ଚିତ୍ର 3h) ତୁଳନାରେ DARS-AS1 (ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣ PACT ତୁଳନାରେ 0.11 ଗୁଣା) ସହିତ ଏହାର ପାରସ୍ପରିକ ସମ୍ପର୍କ ହ୍ରାସ ପାଇଲା | D3 ର DARS ସହିତ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା |-AC1।ଏକାଠି ନିଆଗଲା, ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ସୂଚିତ କରେ ଯେ DARS-AS1 ଏବଂ PACT ମଧ୍ୟରେ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ମୁଖ୍ୟତ D DARS-AS1 ର 3 ′ ଶେଷ ଏବଂ PACT ର D3 ଡୋମେନ୍ ମାଧ୍ୟମରେ ହୋଇପାରେ |
ଆମେ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରିଛୁ ଯେ DARS-AS1 ର PACT ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ଉପରେ କ effect ଣସି ପ୍ରଭାବ ପଡି ନଥିଲା ଏବଂ DARS-AS1 (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3c) ଉପରେ PACT ର କ effect ଣସି ପ୍ରଭାବ ପଡି ନଥିଲା |ତାପରେ ଆମେ ସେଲ୍ ବୃଦ୍ଧି ଉପରେ PACT ନକଡାଉନ୍ ର ପ୍ରଭାବ ପରୀକ୍ଷା କଲୁ |DARS-AS1 ର ବିପରୀତରେ, PACT ନକ୍ସଲ ହେବାପରେ ଆପେକ୍ଷିକ କୋଷଗୁଡିକ 1.5-3 ଗୁଣ ଦ୍ରୁତ ଗତିରେ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3d) |କଲୋନୀ ଗଠନ ଅନୁସନ୍ଧାନର ଫଳାଫଳ ସୂଚାଇ ଦେଇଛି ଯେ PACT (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3e) ସହିତ shRNA ଚିକିତ୍ସା ପରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକ 2-3 ଗୁଣା କଲୋନୀ ଗଠନ କରିଥିଲେ |DARS-AS1 PACT ମାଧ୍ୟମରେ କୋଷ ବିସ୍ତାରକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରେ କି ନାହିଁ ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ, ଆମେ SW620 କୋଷଗୁଡିକ PACT, DARS-AS1 କିମ୍ବା ଉଭୟକୁ ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ କରିଥାଉ |PACT ର ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ କୋଷ ବିସ୍ତାରର ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଦେଖାଇଲା (ଚିତ୍ର 3i) |ଯେତେବେଳେ DARS-AS1 ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ କୋଷ ବିସ୍ତାରକୁ ଯଥେଷ୍ଟ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିଥିଲା, DARS-AS1 ଏବଂ PACT କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଅତ୍ୟଧିକ ଅଭିବୃଦ୍ଧି ହାରରେ କ significant ଣସି ବିଶେଷ ପାର୍ଥକ୍ୟ ନଥିଲା |ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ସୂଚିତ କରେ ଯେ PACT DARS-AS1 ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ ଦ୍ caused ାରା ବୃଦ୍ଧି ହୋଇଥିବା ବିସ୍ତାରକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରିପାରେ |
ଯେହେତୁ DARS-AS1 ର ବିଭିନ୍ନ ଅଞ୍ଚଳରେ ଭିନ୍ନ ଭିନ୍ନ PACT- ବାନ୍ଧିବା କ୍ଷମତା ଅଛି, ଆମେ DARS-AS1 ଖଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକର ବିଭିନ୍ନ ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ ଦ୍ୱାରା କୋଷ ବିସ୍ତାର ଉପରେ ସେମାନଙ୍କର ଆପେକ୍ଷିକ ପ୍ରଭାବ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିଛୁ |ଅନ୍ୟ ଦୁଇଟି ଖଣ୍ଡ ତୁଳନାରେ, DARS-AS1 3 ′ end (384–768 nt) ରେ ଅତ୍ୟଧିକ ଚାପଗ୍ରସ୍ତ ହୋଇଥିଲା, DARS-AS1 ର ମୁଖ୍ୟ PACT ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଅଞ୍ଚଳ, ଯାହା କୋଷ ବିସ୍ତାରକୁ ଉତ୍ସାହିତ କରିବାର ସର୍ବାଧିକ କ୍ଷମତା ଥିଲା (ଚିତ୍ର 3j) |ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ DARS-AS1 ର ବନ୍ଧନ କ୍ଷମତା ଏବଂ ଜ bi ବିକ କାର୍ଯ୍ୟ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ସକାରାତ୍ମକ ସମ୍ପର୍କକୁ ସୂଚିତ କରେ |
PACT ଏକ ପ୍ରୋ-ଆପୋପଟୋଟିକ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବୋଲି ଜଣାଯାଇଛି |ତେଣୁ, ଆପୋପ୍ଟୋସିସ୍ ଉପରେ DARS-AS1 ର ପ୍ରଭାବ ଅନୁସନ୍ଧାନ କଲୁ |ଆଶା କରାଯାଉଥିବା ପରି, DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ PARP ଖଣ୍ଡକୁ ଯଥେଷ୍ଟ ବୃଦ୍ଧି କରିଥିଲା ​​ଏବଂ SW620, HCT116, HepG2, ଏବଂ MBA-MD-231 ସେଲ୍ ରେଖା (ଚିତ୍ର 3k) ରେ ଆନେକ୍ସିନ V- ପଜିଟିଭ କୋଷର ଅନୁପାତକୁ ବ increased ାଇଲା |3) |3f - h), ସୂଚାଇଥାଏ ଯେ କର୍କଟ କୋଷରେ DARS-AS1 ର ଆଣ୍ଟି-ଆପୋପ୍ଟୋଟିକ୍ ପ୍ରଭାବ PACT ର ଆପୋପ୍ଟୋସିସ୍-ପ୍ରବର୍ତ୍ତକ କାର୍ଯ୍ୟର ବିପରୀତ ଅଟେ |ଏକାଠି ନିଆଗଲା, ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ସୂଚିତ କରେ ଯେ DARS-AS1 ଅଙ୍କୋଜେନିକ୍ କାର୍ଯ୍ୟର ଯନ୍ତ୍ରକ P ଶଳ PACT କାର୍ଯ୍ୟର ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଦ୍ୱାରା ହୋଇପାରେ |
ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ଆମେ DARS-AS1-PACT ଆସୋସିଏସନ୍ ର କାର୍ଯ୍ୟକାରିତା ବିଷୟରେ ଅନୁସନ୍ଧାନ କଲୁ |ସିଧାସଳଖ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ମାଧ୍ୟମରେ PKR କୁ ସକ୍ରିୟ କରିବାକୁ PACT ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଛି, ଯାହା ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ eIF2α ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ କୁ ବ ances ାଇଥାଏ, ଯାହା ଅନୁବାଦ ବିଲୋପ ଏବଂ ଆପୋପ୍ଟୋସିସ୍ 17 ସୃଷ୍ଟି କରିଥାଏ |ପ୍ରଥମେ, ଆମେ DARS-AS1 PACT ଏବଂ PKR ର ସେଲୁଲାର୍ ଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ ଉପରେ ପ୍ରଭାବ ପକାଇଥାଏ କି ନାହିଁ ପରୀକ୍ଷା କରିଛୁ |କନଫୋକାଲ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ PACT ଏବଂ PKR SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ହାରାହାରି ପିଆରସନ୍ ସହଭାଗୀ କୋଏଫିସିଏଣ୍ଟ୍ ସହିତ 0.72 ସହିତ ଅତ୍ୟଧିକ କୋଲୋକାଲାଇଜ୍ ହୋଇଥିଲା |ଏହି ସମୟରେ, DARS-AS1 ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ PACT ଏବଂ PKR ସହ-ଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ (ଅର୍ଥାତ୍ ପିଆରସନ୍ ସହଭାଗୀତା 0.61) କୁ ହ୍ରାସ କଲା (ଚିତ୍ର 4a) |DARS-AS1 PACT-PKR ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ମଡ୍ୟୁଲେଟ୍ କରିପାରିବ କି ନାହିଁ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବାକୁ, ଆମେ SW620 ସେଲ୍ ଲାଇସେଟ୍ରେ ଆଣ୍ଟି- PACT ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଏକ କୋ-ଇମ୍ୟୁନୋପ୍ରାଇସିଟେସନ୍ (କୋ-ଆଇପି) ଅନୁଧ୍ୟାନ କରିଥିଲୁ |PKR ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ଆଣ୍ଟି- PACT ରେ ଅତ୍ୟଧିକ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିବାବେଳେ PKR ପୁନରୁଦ୍ଧାର DARS-AS1 କୋଷରୁ ଲାଇସେଟ୍ରେ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ ପାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 4b) |ଭିଟ୍ରୋ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବାଇଣ୍ଡିଂ ଆସେସ୍ ପାଇଁ ଶୁଦ୍ଧ ଲେବଲ୍ PACT ଏବଂ PKR ବ୍ୟବହୃତ ହେଲା |ସେହି ଅନୁଯାୟୀ, ଯେଉଁମାନେ DARS-AS1 ପ୍ରଦାନ କରିଥିଲେ କିନ୍ତୁ କ control ଣସି ନିୟନ୍ତ୍ରଣ RNA ଦମନ କରାଯାଇଥିବା PACT-PKR ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟ ଦେଖାଇଲା ନାହିଁ (ଚିତ୍ର 4c) |ସମସ୍ତ ଫଳାଫଳ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ DARS-AS1 PACT ଏବଂ PKR ଯୋଗାଯୋଗକୁ ବାଧା ଦେଇଛି |
କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ ସେଲ୍ କିମ୍ବା ସେଲ୍ ଗୁଡିକରେ ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ କରୁଥିବା DARS-AS1 ରେ PACT ଏବଂ PKR ର ଏକ କୋ-ଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ କନଫୋକାଲ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ବ୍ୟବହାର କରି ଦେଖାଗଲା |ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟଗୁଡିକ DAPI ସହିତ ଦାଗଯୁକ୍ତ |16 ଟି ଫଟୋଗ୍ରାଫରୁ ପରିସଂଖ୍ୟାନ ଫଳାଫଳ ମିଳିଲା |b କୋ-ଇମ୍ୟୁନୋପ୍ରେସିପିଟେସନ୍ (କୋ-ଆଇପି) SW620 କୋଷର ସେଲ୍ ଲାଇସେଟ୍ରେ ଆଣ୍ଟି- PACT ଆଣ୍ଟିବଡି ବ୍ୟବହାର କରି କିମ୍ବା DARS-AS1 କୋଷକୁ ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ କରେ |c ଲେବଲ୍ PACT, ଶୁଦ୍ଧ PKR ଏବଂ ଭିଟ୍ରୋ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବାନ୍ଧିବା ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ DARS-AS1 କିମ୍ବା ମକ୍ RNA ସହିତ ଭିଟ୍ରୋରେ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରତିରୋପଣ ପାଇଁ ଆଣ୍ଟି-ଫ୍ଲାଗ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |d ସୂଚିତ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଇମ୍ୟୁନୋବ୍ଲଟ୍ SW620 ଏବଂ HCT116 କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ shRNA କିମ୍ବା DARS-AS1-shRNA ଦ୍ trans ାରା ସଂକ୍ରମିତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ପରେ ସେରମ୍ ଅନାହାରରେ |e DARS-AS1 ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ସ୍ତରଗୁଡିକ ଥାପ୍ସିଗାର୍ଜିନ୍ ପାଇଁ ସେଲୁଲାର୍ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତାକୁ ବଦଳାଇଲା |SW620 କୋଷଗୁଡିକ DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ ପ୍ଲାସିମ୍ କିମ୍ବା କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ ପ୍ଲାସିମ୍ ସହିତ ସଂକ୍ରମଣ କରାଯାଇଥିଲା |କକ୍ଷଗୁଡିକ 48 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଥାପ୍ସିଗାର୍ଜିନ୍ ସହିତ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଉଥିଲା ଏବଂ MTS ରିଜେଣ୍ଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରି କୋଷର କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମତା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |f ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଡ୍ DARS-AS1 କିମ୍ବା ଡମି RNA ଏବଂ ଶୁଦ୍ଧ PACT ଭିଟ୍ରୋ ଆକ୍ଟିଭେସନ୍ ଆସେ ଏବଂ ଇମ୍ୟୁନୋବ୍ଲୋଟ୍ ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |g ଏହି ଆଣ୍ଟିବଡି ବ୍ୟବହାର କରି ଇମ୍ୟୁନୋବ୍ଲଟ୍ ଗୁଡିକ SW620-ctrl କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ (ବାମ) କିମ୍ବା PKR ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟଗୁଡିକ (ଡାହାଣ) ଉପରେ ଅତ୍ୟଧିକ ଚାପ କରୁଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ କରାଯାଇଥିଲା |ଏହି କୋଷଗୁଡ଼ିକ ପରେ କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ shRNA କିମ୍ବା DARS-AS1-shRNA ସହିତ ସଂକ୍ରମଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପରେ ସେରମ୍ ଅନାହାର |h ଫ୍ଲୋ ସାଇଟୋମେଟ୍ରି ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ PKR ର ନିଷ୍କ୍ରିୟତା SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ DARS-AS1- ପ୍ରେରିତ ଆପୋପ୍ଟୋସିସ୍ ପାଇଁ କ୍ଷତିପୂରଣ |ସୂଚୀତ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଇମ୍ୟୁନୋବ୍ଲଟ୍ସ SW620 (ବାମ) କିମ୍ବା HCT116 (ଡାହାଣ) କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ କରାଯାଇଥିଲା |କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ shRNA କିମ୍ବା DARS-AS1 shRNA ସହିତ ସଂକ୍ରମିତ କୋଷଗୁଡ଼ିକ ସେରମ୍-ବଞ୍ଚିତ ଏବଂ 100 nM PKR C16 ଇନହିବିଟର କିମ୍ବା DMSO ସହିତ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ |ମାପ ଦଣ୍ଡ = 5 µ ମି।ପ୍ରଦର୍ଶିତ ତଥ୍ୟ ହେଉଛି ତିନୋଟି ପରୀକ୍ଷଣର ହାରାହାରି ± ମାନକ ବିଘ୍ନ |* p ≤ 0.05 ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ପରୀକ୍ଷା |
ସାଧାରଣତ believed ବିଶ୍ believed ାସ କରାଯାଏ ଯେ ଥରେ PACT PKR17 ସହିତ ଯୋଗାଯୋଗ କଲେ, Thr451 ରେ PKR ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ ପ୍ରେରିତ ହୋଇପାରେ |ଆମର ଫଳାଫଳ ସୂଚାଇ ଦେଇଛି ଯେ ସେରମ୍ ଅନାହାର ପରେ DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ PKR ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ ସ୍ତର ଯଥେଷ୍ଟ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 4d ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4a) |ସେହି ଅନୁଯାୟୀ, ଆମେ ଜାଣିଲୁ ଯେ ମୁଖ୍ୟ PKR ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ eIF2α ର ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ ମଧ୍ୟ DARS-AS1 shRNA (ଚିତ୍ର 4d ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4a) ଦ୍ୱାରା ଯଥେଷ୍ଟ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା |ଥାପ୍ସିଗାର୍ଜିନ୍ ହେଉଛି ଏକ ER ଚାପ ଯାହାକି ER କୁ Ca2 + ମୁକ୍ତ କରିଥାଏ |ଥାପ୍ସିଗାର୍ଜିନ୍ ସହିତ ଚିକିତ୍ସା PACT ର ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ଏବଂ ସକ୍ରିୟତା ସୃଷ୍ଟି କରିବାକୁ ରିପୋର୍ଟ କରାଯାଇଛି, ଯାହାକି PKR ସହିତ ଅଧିକ ଯୋଗାଯୋଗ କରିଥାଏ ଏବଂ ସକ୍ରିୟ କରିଥାଏ, ଯାହା eIF2α ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ 18,61 ବୃଦ୍ଧି କରି ଆପୋପ୍ଟୋସିସ୍ ଆଡକୁ ଗତି କରିଥାଏ |ଏଠାରେ, ଆମେ PACT / PKR ପଥର ଉତ୍ତେଜକ ଭାବରେ ଥାପ୍ସିଗାର୍ଜିନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି DARS-AS1 କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ PACT / PKR ପଥକୁ ଅବରୋଧ କରି ଚାପକୁ ଦୂର କରିବାରେ ସାହାଯ୍ୟ କରିପାରିବ କି ନାହିଁ ତାହା ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବାକୁ |ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ DARS-AS1 ଅଭିବ୍ୟକ୍ତିର ସ୍ତର ତାପ୍ସିଗାର୍ଜିନ୍ ସହିତ କୋଷ ପ୍ରତିରୋଧ ସହିତ ସକରାତ୍ମକ ଭାବରେ ଜଡିତ |SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଅତ୍ୟଧିକ ଚାପଗ୍ରସ୍ତ DARS-AS1 ଥାପ୍ସିଗାର୍ଜିନ୍ ସହିତ ଚିକିତ୍ସିତ ହେଲେ ଭଲ ବଞ୍ଚିଥିବାବେଳେ DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ ଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଅଧିକ ସଂକ୍ରମିତ ହୋଇଥିଲେ (ଚିତ୍ର 4e) |ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ସହିତ ସ୍ଥିର, DARS-AS1 ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ ଥାପ୍ସିଗାର୍ଜିନ୍-ପ୍ରେରିତ PKR ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4b) ହ୍ରାସ କଲା |ଏହାର ବିପରୀତରେ, ଥାପ୍ସିଗାର୍ଜିନ୍ ଚିକିତ୍ସା ପରେ, PKR ଏବଂ eIF2α ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କୋଷଗୁଡ଼ିକ ତୁଳନାରେ DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ଅଧିକ ମାତ୍ରାରେ ଫସଫୋରାଇଟେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4b) |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ଥାପ୍ସିଗାର୍ଜିନ୍ ଏକ ଡୋଜ-ନିର୍ଭରଶୀଳ manner ଙ୍ଗରେ DARS-AS1 ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ପ୍ରବର୍ତ୍ତାଇଲା, ଯାହା DARS-AS1 ର ଏକ ଆଣ୍ଟି-ଷ୍ଟ୍ରେସ୍ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ସୂଚାଇପାରେ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4c) |ଏହା ସହିତ, ଏହି ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣଗୁଡ଼ିକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିବା ପାଇଁ ଆମେ ଭିଟ୍ରୋ ଆକ୍ଟିଭେସନ୍ ଆସେସ୍ କରିଥିଲୁ |ସଂକ୍ଷେପରେ, PKR କୁ ଆଣ୍ଟି-ପି.କେ.ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରେ, ଫସଫୋ- PKR WB ବ୍ୟବହାର କରି ଚିହ୍ନଟ ହେଲା |ଆମର ଫଳାଫଳ ସୂଚାଇ ଦେଇଛି ଯେ PKR ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ DARS-AS1 ଦ୍ୱାରା ଯଥେଷ୍ଟ ପ୍ରତିବନ୍ଧିତ ହୋଇଥିଲା, କିନ୍ତୁ RNA ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଦ୍ୱାରା ନୁହେଁ (ଚିତ୍ର 4f) |ଏହି ଭିଟ୍ରୋ ଏବଂ ଭିଭୋ ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ସୂଚିତ କରେ ଯେ DARS-AS1 PACT- ମଧ୍ୟସ୍ଥ PKR ସକ୍ରିୟତାକୁ ପ୍ରତିବନ୍ଧିତ କରେ |ସେହି ସମୟରେ, ଆମେ DARS-AS1 (ଚିତ୍ର 4f) ର ଉପସ୍ଥିତିରେ PACT ପୁନରୁଦ୍ଧାରର ହ୍ରାସକୁ ମଧ୍ୟ ଦେଖିଲୁ |ଏହି ଫଳାଫଳ ଭିଟ୍ରୋ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବାଇଣ୍ଡିଂ ଆସେ (ଚିତ୍ର 4c) ର ଫଳାଫଳ ସହିତ ସମାନ ଏବଂ ପୁନର୍ବାର PACT-PKR ଆସୋସିଏସନ୍ ପାଇଁ DARS-AS1 ର ଅବରୋଧ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରେ |
ସେଲ୍ୟୁଲାର୍ ଚାପରେ PKR ଆକ୍ଟିଭେସନ୍ ପାଇଁ PACT ର D3 ଡୋମେନ୍ ରେ Ser246 ଏବଂ Ser287 ଆବଶ୍ୟକ |ଆଲାନାଇନ୍ ପାଇଁ ଦୁଇଟି ସିରାଇନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟର ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ PACT (mutD) ଦେଇଥିଲା, ଯାହା ଚାପର ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ PKR କୁ ସକ୍ରିୟ କରିଥିଲା ​​ଏବଂ ଆଲାନାଇନ୍ (mutA) ପାଇଁ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ ପ୍ରୋଟୋକଲକୁ ଓଲଟାଇ ଦେଇଥିଲା |ଯେହେତୁ ଆମେ DARS-AS1 ସହିତ ସିଧାସଳଖ ମିଳିତ ଭାବରେ ଏହି ଡୋମେନ୍ ର ମହତ୍ତ୍ demonstrated ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିଛୁ, ଏହି ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକ DARS-AS1 ସହିତ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟରେ ମଧ୍ୟ ଜଡିତ ହୋଇପାରିବ କି ନାହିଁ ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ ଆମେ ଏହି ଦୁଇଟି PACT ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ ସୃଷ୍ଟି କରିଛୁ |କ Interest ତୁହଳର ବିଷୟ, ଉଭୟ ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ DARS-AS1 (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4d) ସହିତ ବାନ୍ଧିବାର କ୍ଷମତା ହରାଇଲେ, DARS-AS1 ସହିତ ଦକ୍ଷ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ପାଇଁ PACT ପ୍ରୋଟିନର ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ଗଠନ ଆବଶ୍ୟକ ହୋଇପାରେ ବୋଲି ମତ ଦେଇଥିଲେ |
ଅଧିକନ୍ତୁ, ଆମର ଫଳାଫଳ ଏହା ମଧ୍ୟ ସୂଚିତ କରେ ଯେ DARS-AS1-shRNA ଦ୍ cell ାରା କୋଷ ବିସ୍ତାରର ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ଏକ ପ୍ରାଧାନ୍ୟ ନକାରାତ୍ମକ PACT ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ (PACTmutA) କିମ୍ବା ଏକ ପ୍ରାଧାନ୍ୟ ନକାରାତ୍ମକ PKR ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟ (PKRmut) (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4e। E) କୁ ଅତ୍ୟଧିକ ଚାପ ଦ୍ୱାରା ଆଂଶିକ ପୁନ restored ସ୍ଥାପିତ ହୋଇପାରିବ |ପ୍ରାଧାନ୍ୟ-ନକାରାତ୍ମକ PKR ମ୍ୟୁଟାଣ୍ଟଗୁଡିକର ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ, DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ ଦ୍ PK ାରା PKR ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ ହ୍ରାସ କରିବା ସହିତ ସେରମ୍-ବଞ୍ଚିତ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ eIF2α ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ (ଚିତ୍ର 4g) ହ୍ରାସ କଲା |ସବୁଠାରୁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କଥା ହେଉଛି, PKRmut (ଚିତ୍ର 4h ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4g) DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ ଦ୍ uc ାରା ଉତ୍ପନ୍ନ ଆପୋପ୍ଟୋଟିକ୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଅନୁପାତ ମଧ୍ୟ ହ୍ରାସ ପାଇଲା |PKR କିନାସ୍ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପର ପ୍ରତିବନ୍ଧକ ମଧ୍ୟ DARS-AS1 କାର୍ଯ୍ୟକୁ ବାଧା ଦେଇଥାଏ, କାରଣ ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ କ୍ୱଚିତ୍ PKR ଏବଂ eIF2α ଫସଫୋରୀଲେସନ୍ ସୃଷ୍ଟି କରିଥିଲା ​​ଯେତେବେଳେ PKR- ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ C16 ଇନହିବିଟର (ଚିତ୍ର 4i ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4h) |)ଏକତ୍ର ନିଆଗଲା, ଆମର ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ସୂଚିତ କରେ ଯେ DARS-AS1 କୋଷ ବିସ୍ତାରକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରେ, ଅନ୍ତତ least ପକ୍ଷେ, PACT- ମଧ୍ୟସ୍ଥ PKR ସକ୍ରିୟତାକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରି |
ଟ୍ୟୁମରିଜେନେସିସରେ DARS-AS1 ର ଭୂମିକାକୁ ଅଧିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବାକୁ, ଆମେ ମାଉସ୍ ଜେନୋଗ୍ରାଫ୍ଟ ମଡେଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଭିଭୋ ପରୀକ୍ଷଣରେ ପ୍ରଦର୍ଶନ କରିଥିଲୁ | ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ଦର୍ଶାଏ ଯେ DARS-AS1 ର ନକଡାଉନ୍ ମୂଷାମାନଙ୍କରେ ଟ୍ୟୁମର ବୃଦ୍ଧିକୁ ନାଟକୀୟ ଭାବରେ ହ୍ରାସ କଲା (p ମୂଲ୍ୟ <0.0001) (ଚିତ୍ର 5a) | ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ଦର୍ଶାଏ ଯେ DARS-AS1 ର ନକଡାଉନ୍ ମୂଷାମାନଙ୍କରେ ଟ୍ୟୁମର ବୃଦ୍ଧିକୁ ନାଟକୀୟ ଭାବରେ ହ୍ରାସ କଲା (p ମୂଲ୍ୟ <0.0001) (ଚିତ୍ର 5a) | Результатя показывают, что аддаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис। 5а) ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ଦର୍ଶାଏ ଯେ DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ ମୂଷାମାନଙ୍କରେ ଟ୍ୟୁମର ବୃଦ୍ଧିକୁ ହ୍ରାସ କରିଥାଏ (p ମୂଲ୍ୟ <0.0001) (ଚିତ୍ର 5a) |AR 表明 AR DARS-AS1 的 敲 低 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. pAR 表明 AR DARS-AS1 的 敲 低 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. p Результатя показали, что аддаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мшей (значение р <0,0001) (рис। 5а) ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ DARS-AS1 ନକଡାଉନ୍ ମୂଷାରେ ଟ୍ୟୁମର ବୃଦ୍ଧିକୁ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ କରିଛି (p ମୂଲ୍ୟ <0.0001) (ଚିତ୍ର 5a) |ଏହିପରି, DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ ଗୋଷ୍ଠୀରେ, ହାରାହାରି ଟ୍ୟୁମର୍ ପରିମାଣରେ ପ୍ରାୟ 72.9% ଏବଂ ହାରାହାରି ଟ୍ୟୁମର୍ ମାସ ପ୍ରାୟ 87.8% ହ୍ରାସ ପାଇଲା (ଚିତ୍ର 5b-d) |ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ଦୃ strongly ଭାବରେ ସୂଚିତ କରେ ଯେ DARS-AS1 ଭିଭୋରେ ଟ୍ୟୁମର ବୃଦ୍ଧିକୁ ଯଥେଷ୍ଟ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରିପାରିବ |
ନଗ୍ନ ମୂଷାରେ କଲୋରେକ୍ଟାଲ୍ ଅଙ୍କୋଜେନେସିସ୍ ଉପରେ ବିଜ୍ଞାପନ DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ ର ପ୍ରଭାବ |ଅଭିବୃଦ୍ଧି ବକ୍ର (କ), ଟ୍ୟୁମର ଆକାର (ଖ), ଓଜନ (ଗ), ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ଚିତ୍ର (d) ଦର୍ଶାଯାଇଛି |ତ୍ରୁଟି ଦଣ୍ଡିକା ± SEM କୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ | n = 10. **** p <0.0001, ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ପରୀକ୍ଷା ଦ୍ୱାରା | n = 10. **** p <0.0001, ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ପରୀକ୍ଷା ଦ୍ୱାରା | n = 10. **** p <0,0001 по дву аононнему критерию Стьюдента। n = 10. **** p <0.0001 ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ପରୀକ୍ଷା |n = 10 **** p <0.0001 ， 通过 双 学生 t 检验。 **** p <0.0001 ， 通过 双 学生 t 检验。 **** p <0,0001 по дву зононнему критерию Стьюдента। **** p <0.0001 ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ପରୀକ୍ଷା |ଇ କପ୍ଲାନ୍-ମିଆର୍ DARS-AS1 ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ସ୍ତର ଏବଂ UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, ଏବଂ LGG ରୋଗୀଙ୍କ ମଧ୍ୟରେ ବଞ୍ଚିବା ମଧ୍ୟରେ ସମ୍ପର୍କକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିଥିଲେ |ରୋଗୀମାନଙ୍କରେ ଉଚ୍ଚ ସ୍ତରର DARS-AS1 ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ଶୀର୍ଷ 50% ରେ ଥିଲା;ରୋଗୀମାନଙ୍କରେ DARS-AS1 ଅଭିବ୍ୟକ୍ତିର ନିମ୍ନ ସ୍ତର 50% ତଳେ ଥିଲା |p- ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ଲଗ୍ ର୍ୟାଙ୍କ୍ ପରୀକ୍ଷା ବ୍ୟବହାର କରି ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |f ପ୍ରସ୍ତାବିତ ମଡେଲ୍ ଯେଉଁଥିରେ DARS-AS1 PACT-PKR ପଥ ଏବଂ ଟ୍ୟୁମର ବୃଦ୍ଧିକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିଥାଏ |
DARS-AS1 ର କ୍ଲିନିକାଲ୍ ପ୍ରଭାବକୁ ଭଲ ଭାବରେ ବୁ understand ିବାକୁ, ଆମେ ଏହାର ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ଏବଂ ରୋଗୀର ବଞ୍ଚିବା ମଧ୍ୟରେ ସମ୍ପର୍କକୁ ପରୀକ୍ଷା କରିଥିଲୁ |TCGA ଡାଟାସେଟକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରି, ଆମେ ଜାଣିଲୁ ଯେ ଉଚ୍ଚ DARS-AS1 ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ଉଭାଲ ମେଲାନୋମା (UVM), ବୃକକ୍ କ୍ରୋମୋଫୋବିୟା (KICH), ବୃକକ୍ ପପିଲାରୀ ସେଲ୍ କାରସିନୋମା (KIRP), ମେସୋଥେଲିଓମା (MESO), ମଲ୍ଟିପ୍ଲେକ୍ସ ସହିତ ଜଡିତ |ଗ୍ଲୋଏବ୍ଲାଷ୍ଟୋମା ମର୍ଫୋସିସ୍ (GBM) ଏବଂ ନିମ୍ନ ଗ୍ରେଡ୍ ମସ୍ତିଷ୍କ ଗ୍ଲୋମା (LGG) ରୋଗୀ (ଚିତ୍ର 5e) ସହିତ ନିମ୍ନ ବଞ୍ଚିବା ଯଥେଷ୍ଟ ଜଡିତ ଥିଲା |ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ସୂଚିତ କରେ ଯେ DARS-AS1 କ୍ଲିନିକାଲ୍ ଟ୍ୟୁମର ପ୍ରଗତିରେ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭୂମିକା ଗ୍ରହଣ କରିପାରନ୍ତି ଏବଂ ଏକାଧିକ କର୍କଟରେ ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଭବିଷ୍ୟବାଣୀକାରୀ ବାୟୋମାର୍କର୍ ହୋଇପାରେ |
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ, ବଡ଼ ଆକାରର CRISPRi କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ସ୍କ୍ରିନିଂ ବ୍ୟବହାର କରି, ଆମେ ସ୍ଥିର କଲୁ ଯେ DARS-AS1 lncRNA ଦୁଇଟି ମୁଖ୍ୟ ଚାପ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକାରୀ, PACT ଏବଂ PKR କୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରି କର୍କଟ କୋଷର ଚାପକୁ ଅତିକ୍ରମ କରେ |ସିଧାସଳଖ PACT ସହିତ ଯୋଗାଯୋଗ କରି, DARS-AS1 PACT- ମଧ୍ୟସ୍ଥ PKR ସକ୍ରିୟତାକୁ ପ୍ରତିବନ୍ଧିତ କଲା, ଯାହା ଦ୍ ap ାରା ଆପୋପଟୋଟିକ୍ କୋଷ ମୃତ୍ୟୁକୁ ରୋକିଥାଏ ଏବଂ କୋଷ ବିସ୍ତାରକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରେ (ଚିତ୍ର 5f) |ଏକାଧିକ ପ୍ରକାରର କର୍କଟ ରୋଗରେ DARS-AS1 ର ଉପାଦାନ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇଛି, ଏହା ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଚାପଗ୍ରସ୍ତ ଅବସ୍ଥାରେ କର୍କଟ କୋଷର ବଞ୍ଚିବା ପାଇଁ ଏହାର କାର୍ଯ୍ୟ ଏକାଧିକ ପ୍ରକାରର କର୍କଟ ପାଇଁ ପ୍ରଯୁଜ୍ୟ ହୋଇପାରେ |
PACT କୁ PKR ଆକ୍ଟିଭେଟର ପ୍ରୋଟିନ୍ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଛି, ଏବଂ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍, ଅନୁବାଦ, ଆପୋପ୍ଟୋସିସ୍ ଏବଂ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ସେଲୁଲାର୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରି ଚାପ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ PACT- ମଧ୍ୟସ୍ଥ PKR ଆକ୍ଟିଭେସନ୍ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଭୂମିକା ଗ୍ରହଣ କରିଥାଏ |ଦଶନ୍ଧି ଧରି, PACT-PKR କ୍ୟାସକେଡ୍ର କର୍କଟ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ନିୟମାବଳୀ ବୁ understand ିବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରାଯାଇଛି |ଏଠାରେ, ଆମର ଅଧ୍ୟୟନରେ ସେଲ୍ୟୁଲାର୍ lncRNA DARS-AS1 ମାଧ୍ୟମରେ କର୍କଟ କୋଷରେ PACT-PKR ର ନିୟନ୍ତ୍ରଣର ଏକ ଭିନ୍ନ ପ୍ରଣାଳୀ ପ୍ରକାଶ ପାଇଲା, ଯାହା ସିଧାସଳଖ PACT ସହିତ ବାନ୍ଧିଥାଏ, PACT-PKR ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ଅବରୋଧ କରିଥାଏ, PKR ସକ୍ରିୟତା ଏବଂ eIF2α ଫସଫୋରୀଲେସନକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରିଥାଏ, ଯାହା ଦ୍ stress ାରା ଚାପ-ପ୍ରେରିତ ଆପୋପ୍ଟୋସିସ୍ ଏବଂ ଶେଷରେ କର୍କଟ ବିସ୍ତାରକୁ ଉତ୍ସାହିତ କରେ |କକ୍ଷଗୁଡ଼ିକଏହି ଆବିଷ୍କାର କର୍କଟ ରୋଗର ପୂର୍ବାନୁମାନ ଏବଂ ଥେରାପି ପାଇଁ ସମ୍ଭାବ୍ୟ lncRNA ଲକ୍ଷ୍ୟ ଉପରେ ଆଲୋକ ପ୍ରଦାନ କରେ |
ଆମର ତଥ୍ୟ ଦର୍ଶାଇଛି ଯେ ଫସଫୋରାଇଟେଡ୍ PKR ଏବଂ eIF2α ର ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ବୃଦ୍ଧି ସହିତ DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ସେରମ୍ ଅନାହାରରେ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ କରେ |ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ସୂଚିତ କରେ ଯେ DARS-AS1 PACT / PKR କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରି କଠିନ ଅବସ୍ଥାରେ କର୍କଟ କୋଷର ବଞ୍ଚିବାକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରେ |ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ଅନେକ ଅଣ-କୋଡିଂ RNA, ଯେପରିକି ASPACT ଏବଂ nc886, PACT48 mRNA କୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରି କିମ୍ବା PKR49,50,64 କୁ ବାନ୍ଧି ଅଟୋଫୋସଫୋରୀଲେସନ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରି PACT / PKR ଅକ୍ଷରେ ଜଡିତ |ସେଥିମଧ୍ୟରୁ, DARS-AS1 PACT-PKR ଆସୋସିଏସନର ବ୍ୟାଘାତକାରୀ ଭାବରେ କାର୍ଯ୍ୟ କରେ |ଏହି ଅଧ୍ୟୟନ ଆମର PACT / PKR ଅକ୍ଷ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଏବଂ ଚାପ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ lncRNA ର ଭୂମିକା ବିଷୟରେ ଆମର ବୁ understanding ାମଣାକୁ ସମୃଦ୍ଧ କରେ |
PACT ତିନୋଟି ଅଲଗା ଡୋମେନ୍ ଧାରଣ କରେ |ପ୍ରଥମ ଦୁଇଟି dsRBD ମଧ୍ୟରୁ ପ୍ରତ୍ୟେକଟି PACT ରୁ PKR ର ଉଚ୍ଚ ଆଫିନିଟି ବାନ୍ଧିବା ପାଇଁ ଯଥେଷ୍ଟ ହୋଇଥିବାବେଳେ ଭିଟ୍ରୋ ଏବଂ ଭିଭୋରେ PKR ସକ୍ରିୟତା ପାଇଁ ତୃତୀୟ ଡୋମେନ୍ (D3) ଆବଶ୍ୟକ |ଆମର ଅଧ୍ୟୟନ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ DARS-AS1 D3 ଡୋମେନ୍ (ଚିତ୍ର 3 ଘଣ୍ଟା) ସହିତ ବିଶେଷ ଭାବରେ ଯୋଗାଯୋଗ କରିଥାଏ |LncRNA (768 ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍) ର ବୃହତ ଆକାରକୁ ଦେଖିଲେ, D3 ସହିତ ବାନ୍ଧୁଥିବା DARS-AS1 ଶାରୀରିକ ଭାବରେ dsRBD ଏବଂ PKR ର PACT ଡୋମେନ୍ ମଧ୍ୟରେ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ବାଧା ଦେଇପାରେ, ଯାହା ଦ୍ P ାରା PACT ଏବଂ PKR ର ଆସୋସିଏସନ୍ ଅବରୋଧ ହୋଇପାରେ |PACT ପଏଣ୍ଟ ମ୍ୟୁଟେସନ୍ ଯାହା D24 ରେ Ser246 ଏବଂ Ser287 କୁ ଆଲାନାଇନ୍ କିମ୍ବା ଆସପାର୍ଟେଟ୍ ସହିତ ବଦଳାଇଲା, DARS-AS1 ପାଇଁ ଏହାର ବନ୍ଧନ ସମ୍ବନ୍ଧକୁ ବ୍ୟାହତ କଲା, D3 ର ସାମଗ୍ରିକ ଗଠନମୂଳକ ଏବଂ ବ electrical ଦୁତିକ ଗୁଣଗୁଡିକର ଆସୋସିଏସନରେ ଏହାର ମହତ୍ତ୍ .କୁ ସୂଚାଇଲା |ଭବିଷ୍ୟତରେ ଅଧିକ ସଠିକ୍ ବାୟୋକେମିକାଲ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ଉଚ୍ଚ ରେଜୋଲୁସନ PACT ଗଠନମୂଳକ ବିଶ୍ଳେଷଣ ବ୍ୟବହାର କରି ଏହି ଯନ୍ତ୍ରର ଅଧିକ ବିବରଣୀ ଭବିଷ୍ୟତରେ ଆବଶ୍ୟକ ହେବ |
ପୂର୍ବ ଅଧ୍ୟୟନଗୁଡିକ ରିପୋର୍ଟ କରିଛି ଯେ DARS-AS1 ଅନେକ ଯନ୍ତ୍ରକ through ଶଳ ମାଧ୍ୟମରେ କୋଷ ବିସ୍ତାରକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରେ 51,52,53 |ଗୋଟିଏ ଉଦାହରଣରେ, ଅନୁସନ୍ଧାନକାରୀମାନେ ଦେଖିଲେ ଯେ କିଡନୀ କର୍କଟ କୋଷରେ miP-194-5p କୁ ଟାର୍ଗେଟ କରି DARS-AS1 ଏହାର ଆଣ୍ଟିସେନ୍ସ ପ୍ରୋଟିନ୍-ଏନକୋଡିଂ DARS ଜିନ୍କୁ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ କରିଛି |ଅବଶ୍ୟ, ବର୍ତ୍ତମାନର ଅଧ୍ୟୟନରେ, DARS-AS1 ନକ୍ଡାଉନ୍ ଅନ୍ତତ least ପକ୍ଷେ କଲୋରେକ୍ଟାଲ୍, ସ୍ତନ ଏବଂ ଯକୃତ କର୍କଟ ସମେତ ଏକାଧିକ ପ୍ରକାରର କର୍କଟରେ DARS ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଉପରେ କ little ଣସି ପ୍ରଭାବ ପକାଇ ନଥିଲା |କାରଣ lncRNA ଗୁଡ଼ିକ କୋଷ- ଏବଂ ଟିସୁ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି s ାଞ୍ଚାଗୁଡ଼ିକୁ ପ୍ରଦର୍ଶିତ କରେ, କର୍କଟ ପ୍ରଣାଳୀରେ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ ଯନ୍ତ୍ରକ cons ଶଳ ସଂରକ୍ଷିତ ହୋଇନପାରେ, ଯାହା ଆମର ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ ଏବଂ ବିଭିନ୍ନ କର୍କଟ ରୋଗର ପୂର୍ବ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ ମଧ୍ୟରେ ଏହି ଅସଙ୍ଗତିକୁ ସହାୟକ ହୋଇପାରେ |ବିଭିନ୍ନ ଶାରୀରିକ ଏବଂ ପାଥୋଲୋଜିକାଲ୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଯନ୍ତ୍ରକ uc ଶଳକୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରିବା ପାଇଁ ସ୍ୱତନ୍ତ୍ର ଅଧ୍ୟୟନ ଆବଶ୍ୟକ |
କ୍ଲିନିକାଲ୍ ତଥ୍ୟର ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ଟ୍ୟୁମରରେ DARS-AS1 ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି କର୍କଟ ରୋଗୀଙ୍କ ବଞ୍ଚିବା ସହିତ ବିପରୀତ ଭାବରେ ଜଡିତ, ଯାହା କର୍କଟ ରୋଗର ପୂର୍ବାନୁମାନରେ DARS-AS1 / PACT / PKR ଅକ୍ଷରର ଗୁରୁତ୍ୱକୁ ସୂଚିତ କରେ |ପରିଶେଷରେ, ଆମର ଅଧ୍ୟୟନ ଦର୍ଶାଏ ଯେ DARS-AS1 ହେଉଛି PACT / PKR ସିଗ୍ନେଚର ଅକ୍ଷରର ନିୟନ୍ତ୍ରକ, କର୍କଟ କୋଷ ବିସ୍ତାରକୁ ପ୍ରୋତ୍ସାହିତ କରେ ଏବଂ ଚାପ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ଆପୋପ୍ଟୋସିସକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରିଥାଏ, ଯାହାକି ଅନୁସନ୍ଧାନର ଅନ୍ୟ ଏକ ଧାଡି ପ୍ରଦାନ କରିଥାଏ ଏବଂ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଚିକିତ୍ସା ଉପରେ ଭବିଷ୍ୟତ ଅନୁସନ୍ଧାନ ପାଇଁ ଆଗ୍ରହୀ | ।
ଚାଇନାର ଜାତୀୟ ସେଲ୍ ଲାଇନ୍ ଉତ୍ସ ଭିତ୍ତିଭୂମିରୁ ମାନବ ସେଲ୍ ଲାଇନ୍ SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ଏବଂ HEK293T ମିଳିଲା |ସମସ୍ତ କୋଷଗୁଡିକ DMEM ମାଧ୍ୟମ (DMEM, ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍, ୱାଲ୍ଟାମ, MA) ରେ 10% FBS (ମିଥୁନ, ବ୍ରୁକଲିନ୍, NY) ଏବଂ 37% C, 5% CO2 ରେ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା |ଇନକ୍ୟୁବେଟର
ଆଣ୍ଟି- PACT, ଆବକମ୍ (ab31967);ଆଣ୍ଟି- PKR, Abcam (ab184257);ଆଣ୍ଟି- PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);ଆଣ୍ଟି ଫ୍ଲାଗ୍, ଆବକମ୍ (ab125243);ଆଣ୍ଟି- eIF2α, ଅବକାମ (A0764));ଆଣ୍ଟି- eIF2α (ଫସଫରସ୍ S51), ଅବକାମ (ab32157);ଆଣ୍ଟି- PACT (ଫସଫରସ୍ S246), ଅବଜେଣ୍ଟ୍ (AP7744b);ଆଣ୍ଟି- tub- ଟୁବୁଲିନ୍, CST (2128);ସାଧାରଣ ମାଉସ୍ IgG, CST (5415S);ସାଧାରଣ ରାବଣ IgG, CST (2729S) |ପାଶ୍ଚାତ୍ୟ ବ୍ଲୋଟିଂ ପାଇଁ PBST ରେ ଆଣ୍ଟିବଡିଗୁଡିକ 1: 1000 ଏବଂ IP ପାଇଁ 1: 100 କୁ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା |
CRISPR-ERA66 ନାମକ ଏକ ସାର୍ବଜନୀନ ଉପଲବ୍ଧ ଉପକରଣ ବ୍ୟବହାର କରି sgRNA ଗୁଡ଼ିକ ବିକଶିତ ହେଲା |SgRNA ବିକାଶ ପାଇଁ ଆମେ ଡିଫଲ୍ଟ ଟୁଲ୍ ପାରାମିଟର ଏବଂ 3 kb ଅଞ୍ଚଳରେ ଆଲଗୋରିଦମ ଗଣିତ sgRNA ବାଇଣ୍ଡିଂ ସାଇଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ |TSS ରେ କେନ୍ଦ୍ରିତ |SgRNA ଅଲିଗ୍ନୁକ୍ଲାଏଟାଇଡ୍ସର ପୁଲଗୁଡିକ କଷ୍ଟମ ଆରେ, Inc.ସମୁଦାୟ 12 µg ପୁଲଡ୍ ମାନବିକୃତ pgRNA ପ୍ଲାସିମ୍, 7.2 µg psPAX2 (ଆଡ୍ଗେନ # 12260), ଏବଂ 4.8 µg pMD2.G (ଆଡ୍ଗେନ # 12259) 10 ସେମି ଡିସ୍ ରେ DNA ସଂକ୍ରମଣ ଟ୍ରାନ୍ସଜେକ୍ସନ୍ ରିଜେଣ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି 5 x 106 HEK293T ରେ ମିଳିତ ଭାବରେ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ ହୋଇଥିଲା | ଉତ୍ପାଦକଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ କୋଷଗୁଡିକ (CWBIO, ବେଜିଂ, ଚୀନ୍) |ଭାଇରସ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ଅଲ ern କିକ ପଦାର୍ଥଗୁଡିକ ସଂକ୍ରମଣର 48 ଏବଂ 72 ଘଣ୍ଟା ପରେ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇ 0.45 µm ଫିଲ୍ଟର୍ ମାଧ୍ୟମରେ ଫିଲ୍ଟର୍ କରାଯାଇଥିଲା |ସ୍କ୍ରିନିଂ ପାଇଁ, dCas9 / KRAB ଫ୍ୟୁଜନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା SW620 କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଜୀବାଣୁ ସଂକ୍ରମଣ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରାପ୍ତ ହେଲା |ପରିବର୍ତ୍ତିତ SW620 କୋଷଗୁଡିକ MOI ରେ 0.1-0.3 ର ଚାରିଟି ସ୍ independent ାଧୀନ ସଂକ୍ରମଣ ପରୀକ୍ଷଣରେ ଜୀବାଣୁ ଲାଇବ୍ରେରୀରେ ସଂକ୍ରମିତ ହୋଇଥିଲେ ଏବଂ 2 ଦିନ ପାଇଁ 2 μg / ml puromycin (ସିଗମା, ସେଣ୍ଟ୍ ଲୁଇସ୍, MO) ସହିତ ନମୁନା ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା |ତା’ପରେ, ସ୍କ୍ରିନିଂ ପାଇଁ ସର୍ବନିମ୍ନ 500 କକ୍ଷ / sgRNA କଭରେଜ୍ ସହିତ କୋଷଗୁଡିକ 18 ଦିନ ଭିଟ୍ରୋରେ ସଂସ୍କୃତି ପ୍ରାପ୍ତ ହେଲା |
QIAamp DNA ବ୍ଲଡ ମିଡି କିଟ୍ (QIAGEN, Düsseldorf, ଜର୍ମାନୀ; 51183) ଙ୍କ ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ ଜେନୋମିକ୍ DNA ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା |ଲାଇବ୍ରେରୀ ନିର୍ମାଣ ପାଇଁ ସମୁଦାୟ, ଜ bi ବିକ ପୁନରାବୃତ୍ତି ପାଇଁ 100 μg ଜେନୋମିକ୍ DNA ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |SgRNA ଅଞ୍ଚଳ ଦୁଇ ରାଉଣ୍ଡ PCR ଦ୍ୱାରା ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ ବାରକୋଡ୍ ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ |
PCR ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ NucleoSpin® gel ଏବଂ PCR ବିଶୋଧନ କିଟ୍ (MACHEREY-NAGEL, Düren, ଜର୍ମାନୀ; 740609.250) ବ୍ୟବହାର କରି ଶୁଦ୍ଧ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ କ୍ୟୁବିଟ୍ ™ HS ଦ୍ୱିଗୁଣିତ DNA ଚିହ୍ନଟ କିଟ୍ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍; Q32854) ବ୍ୟବହାର କରି ପରିମାଣ କରାଯାଇଥିଲା |
କୋଷ ବିସ୍ତାର ମାପିବା ପାଇଁ MTS ଅନୁଧ୍ୟାନ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |2000 କୋଷ / କୂଅର ପ୍ରାରମ୍ଭିକ ଘନତ୍ୱରେ 96-କୂଅ ପ୍ଲେଟରେ କୋଷଗୁଡିକ ବିହନ କରାଯାଇଥିଲା |ସମୁଦାୟ 4-6 ଦିନ ପାଇଁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ସମୟରେ କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଆପେକ୍ଷିକ ସଂଖ୍ୟା ପ୍ରତିଦିନ ମାପ କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରତ୍ୟେକ କୂଅ ପାଇଁ, 20 μl MTS ରେଜେଣ୍ଟ୍ (ପ୍ରୋମେଗା) 100 μl DMEM ସହିତ ମିଶ୍ରିତ ହୋଇଥିଲା, 37 ° C ରେ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ କୋଷ ସହିତ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପରେ OD490 ମାପ କରାଯାଇଥିଲା |
କ୍ଷେତ୍ରଗୁଡିକର ଗଠନକୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରି ଅଣସଂରକ୍ଷିତ ଅଭିବୃଦ୍ଧିର କ୍ଷମତା ଆବିଷ୍କୃତ ହେଲା |ସଂକ୍ଷେପରେ, shRNA DARS-AS1 କିମ୍ବା କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ shRNA ସହିତ ଟ୍ରାନ୍ସଫେକ୍ଟ ହୋଇଥିବା 2000 କୋଷଗୁଡିକ ପ୍ରତି 4 ଦିନରେ ମଧ୍ୟମ ପରିବର୍ତ୍ତନ ସହିତ ଅଲ୍ଟ୍ରା ଲୋ ସଂଲଗ୍ନ ମାଇକ୍ରୋପ୍ଲେଟ୍ (କର୍ନିଙ୍ଗ) ରେ ସଂସ୍କୃତି ପ୍ରାପ୍ତ ହେଲା |14 ଦିନ ପରେ ସ୍ପେରେଏଡ୍ ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ବର୍ଦ୍ଧିତ ଅନୁଧ୍ୟାନ ପାଇଁ DARS-AS1 ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ ପ୍ଲାସିମ୍ କିମ୍ବା ଏକ କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ ପ୍ଲାସିମ୍ ସହିତ 500 କୋଷ ଟ୍ରାନ୍ସଫେକ୍ଟ କରାଯାଇଥିଲା, ଅନ୍ୟଥା ପଦ୍ଧତି ଅପରିବର୍ତ୍ତିତ ନଥିଲା |
Riboprobe® କମ୍ବିନେସନ୍ ସିଷ୍ଟମ୍ (ପ୍ରୋମେଗା P1440) ର ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ଅନୁଯାୟୀ T7 RNA ପଲିମେରେଜ୍ ଏବଂ ବାୟୋଟିନ୍ -16-ୟୁଟିପି (ରୋଚ୍ 1138908910) ବ୍ୟବହାର କରି RNA ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ସିତ ହେଲା |ଏଠାରେ ବ୍ୟବହୃତ ପ୍ରାଇମର୍ ଗୁଡିକ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ସାରଣୀ 4 ରେ ତାଲିକାଭୁକ୍ତ |
ପ୍ରୋଟିନ୍-କୋଡିଂ PACT କିମ୍ବା PKR ଅଞ୍ଚଳଗୁଡିକ pET15b (ଆଡଗେନ # 73619) ରେ କ୍ଲୋନ ହୋଇ BL21 (DE3) ରେ ରୂପାନ୍ତରିତ ହେଲା |ଜୀବାଣୁ ରାତାରାତି ଆମ୍ପିସିଲିନ୍ ଯୋଗାଉଥିବା LB ରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ତା’ପରେ ତାଜା LB ସହିତ 100 ଗୁଣା ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା |ଯେତେବେଳେ ମାଧ୍ୟମର OD600 0.8 ରେ ପହଞ୍ଚିଲା, ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ସୃଷ୍ଟି କରିବାକୁ 1 ମିଟର IPTG ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |କୋମଳ କମ୍ପନ ସହିତ ରାତାରାତି ଇନକ୍ୟୁବେସନ ପରେ (250 rpm 20 ° C), ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗେସନ୍ (4000 rpm, 10 ମିନିଟ୍, 4 ° C) ଦ୍ୱାରା ସେଲ୍ ପେଲେଟ୍ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା |ଲାଇସିସ୍ ବଫର୍ (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ରେ ସେଲ୍ ପେଲେଟ୍କୁ ପୁନ us ପଠାନ୍ତୁ ଏବଂ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ବରଫରେ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ, ତା’ପରେ ସୋନିକେଟ୍ (15 ମିନିଟ୍, 5 s ଅନ୍ / ଅଫ୍, ବରଫ) ଏବଂ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ (13,000) rpm), 30 ମିନିଟ୍, 4 ° С) |ଅଲ ern କିକ ତତ୍କାଳୀନ Ni-NTA ରଜନୀ (QIAGEN) ଉପରେ 4 ° C ରେ 3 ​​ଥର ଲୋଡ୍ ହେଲା, ୱାଶ୍ ବଫର୍ (50 ମିମି ଟ୍ରାଇସ୍, pH 8.0, 40 ମିମି ଇମିଡାଜୋଲ, 250 ମିଟର NaCl) ସହିତ 4 ଥର ଧୋଇଗଲା ଏବଂ ସମୁଦାୟ 3 ଥର ବ uted ିଗଲା | 10 ମିଲି ଏଲିଏଣ୍ଟ ବଫର (50 ମିମି ଟ୍ରାଇସ୍, pH 8.0, 250 MM NaCl, 300 mM imidazole) |ଡବ୍ଲୁବି ବ୍ୟବହାର କରି ଶୁଦ୍ଧ ପ୍ରୋଟିନ୍ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ କ୍ୟୁବିଟ୍ ™ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଆସେ କିଟ୍ (ଥର୍ମୋ ଫିସର ସାଇଣ୍ଟିଫିକ୍; Q 33212) ବ୍ୟବହାର କରି ଏକାଗ୍ରତା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |
ସଂଶୋଧନ ସହିତ RIP ଅନୁଧ୍ୟାନଗୁଡିକ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଥିବା ପରି କରାଯାଇଥିଲା |ସଂକ୍ଷେପରେ, 1x RIP ବଫର୍ (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x 107 cocktail (ରୋଚେ, 1 ମିମି DTT) ଏବଂ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ 13,000 rpm ରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 4 ° C ରେ |ଅଲ ern କିକ ତତ୍ତ୍ୱ ପରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ A + G ଚୁମ୍ବକୀୟ ବିଡ୍ (ମିଲିପୋର) ସହିତ 5 μg ଆଣ୍ଟି- PACT ଆଣ୍ଟିବଡି (ଆବେମ୍) କିମ୍ବା IgG (CST) ସହିତ ମିଳିତ ହୋଇଥିଲା |ବିଡିଗୁଡିକ 5x RIP ବଫର୍ ସହିତ 5 ଥର ଧୋଇ ଦିଆଗଲା, ତାପରେ ପ୍ରୋଟିନେଜ୍ କେ (NEB) ସହିତ ହଜମ ହେଲା |ଟ୍ରାଇଜୋଲ ସହିତ RNA ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ RT-qPCR ଦ୍ୱାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରାଥମିକ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଟେବୁଲ୍ 5 ରେ ଉପସ୍ଥାପିତ ହୋଇଛି |
ଏକ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ମାନକ RIP ଆସେ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ ଅନୁଯାୟୀ ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ RIP ଆସେ କରାଯାଇଥିଲା |ଭିଟ୍ରୋ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପଡ୍ RNA ର ମୋଟ 5 pmol RIP ବଫର୍ ସହିତ 1x କୁ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 65 ° C ରେ ଇନକ୍ୟୁବେସନ ଦ୍ 5 ାରା 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଆନ୍ନାଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପରେ ରୁମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ ଧୀରେ ଧୀରେ ଥଣ୍ଡା ହୋଇଗଲା |ଇ.କୋଲିରୁ ସମୁଦାୟ 5 pmol ଅକ୍ଷୁର୍ଣ୍ଣ କିମ୍ବା ପରିବର୍ତ୍ତନ ହୋଇଥିବା ଫ୍ଲାଗ୍-ଲେବଲ୍ PACT ପ୍ରୋଟିନ୍ ଶୁଦ୍ଧ କରାଯାଇଥିଲା |° ° C ରେ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ପୁନ at ନାମିତ RNA ସହିତ ଇନକ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ଫ୍ଲାଗ୍ ଆଣ୍ଟି IP ପାଇଁ RIP ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଉପରୋକ୍ତ ପଦ୍ଧତି ଅନୁସରଣ କରନ୍ତୁ |
RNA ବିସ୍ତାର ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, 1 × 107 କୋଷଗୁଡିକ 1xRIP ବଫର୍ ସହିତ ଲାଇଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା |4,000 C ରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 13,000 rpm ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗେସନ୍ ପରେ, ଅଲ ern କିକ ଶକ୍ତି 30 μl ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ ଚୁମ୍ବକୀୟ ବିଡ୍ (ବେକମ୍ୟାନ୍) ସହିତ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 4 ° C ରେ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା |ଶୁଦ୍ଧ ଲାଇସେଟ୍ ପରେ ଖମୀର tRNA ସହିତ ଯୋଗାଇ ଦିଆଗଲା ଏବଂ ରାତି 40 ଟା ରେନୋନାଟେଡ୍ RNA ର 4 ° C ରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଡ୍ ହେଲା, ତା’ପରେ ଆଉ 2 ଘଣ୍ଟା ଏବଂ 20 μl ନୂତନ ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ ଚୁମ୍ବକୀୟ ବିଡି ସହିତ BSA ସହିତ ଅବରୋଧ କରାଯାଇଥିଲା |ୱାଶିଂ ଷ୍ଟେପ୍ 5x RIP ବଫର୍ ସହିତ 4 ଥର ଏବଂ 1x RIP ବଫର୍ ସହିତ 4 ଥର ଗଠିତ |ସଂପୃକ୍ତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ବାୟୋଟିନ୍ ଏଲିଟେସନ୍ ବଫର୍ (25 ମିଟର ଟ୍ରାଇସ୍- HCl, pH 7.5, 12.5 ମିମି ଡି-ବାୟୋଟିନ୍, PMSF) ସହିତ ବ uted ାଯାଇଥିଲା ଏବଂ NuPAGE 4-12% ବିସ୍-ଟ୍ରାଇସ୍ ଜେଲ୍ (ଇନଭାଇଟ୍ରୋଜେନ୍) ରେ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା |ରୂପା ଦାଗ (ବିୟୋଟାଇମ୍ ବାୟୋଟେକ୍ନୋଲୋଜି) ପରେ, କିଛି ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଏମଏସ୍ ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ତେଜିତ ଏବଂ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |
PACT ଏବଂ PKR ମଧ୍ୟରେ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ କୋ-ଆଇପି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |ସଂକ୍ଷେପରେ, 1 x 107 ଲାଇସେଡ୍ କୋଷକୁ 1 x RIP ବଫର୍ରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବେନ୍ କରି ଅଲ ern କିକ ଲାଇସେଟ୍ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପରେ 13,000 rpm ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗେସନ୍ ଦ୍ 15 ାରା 4 ° C ରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା |ଲାଇସେଟ୍ ଗୁଡିକ ପ୍ରୋଟିନ୍ A + G ଚୁମ୍ବକୀୟ ବିଡ୍ ସହିତ ଧାରଣ କରାଯାଇଥିଲା, 5 µg ଆଣ୍ଟି- PACT ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ମିଳିତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ରାତିସାରା 4 ° C ରେ ଧୀରେ ଧୀରେ ଘୂର୍ଣ୍ଣନ କରାଯାଇଥିଲା |ବିଡିଗୁଡିକ × × RIP ବଫର୍ ସହିତ times ଥର ଧୋଇଗଲା, ଦୁଇଥର 1 × RIP ବଫର୍ ସହିତ 1 × SDS ବଫର୍ ସହିତ ବ uted ାଗଲା |ପୁନରୁଦ୍ଧାର ହୋଇଥିବା ପ୍ରୋଟିନକୁ SDS-PAGE ଜେଲ ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ WB ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା |
ଫ୍ଲାଗଡ୍ PACT ର ଦୁଇଟି pmol ଏବଂ PKR ର 1 pmol ଇ କୋଲିରୁ ଶୁଦ୍ଧ କରାଯାଇଥିଲା |1 × RIP ବଫର୍ ରେ ହଳଦୀ କରନ୍ତୁ ଏବଂ ରାତି 10 ଟା ରେନୋନାଟେଡ୍ RNA ସହିତ 2 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 4 ° C ରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଟ୍ କରନ୍ତୁ |ଏହା ପରେ, ସେମାନେ ପ୍ରୋଟିନ୍ A + G ଚୁମ୍ବକୀୟ ବିଡ୍-କଞ୍ଜୁଗେଟେଡ୍ ଆଣ୍ଟି-ଲେବଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଅତିରିକ୍ତ ଦୁଇ ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ ହୋଇଥିଲେ |ପରେ ବିଡିଗୁଡିକ 1x RIP ବଫର୍ ସହିତ ଚାରିଥର ଧୋଇ ଦିଆଗଲା ଏବଂ 1x SDS ବଫର୍ ସହିତ ବ uted ଼ାଗଲା |ଫଳାଫଳ PACT ଏବଂ PKR WB ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ ହେଲା |