ସମ୍ବାଦ

Nature.com ପରିଦର୍ଶନ କରିଥିବାରୁ ଧନ୍ୟବାଦ |ଆପଣ ବ୍ୟବହାର କରୁଥିବା ବ୍ରାଉଜର୍ ସଂସ୍କରଣରେ ସୀମିତ CSS ସମର୍ଥନ ଅଛି |ସର୍ବୋତ୍ତମ ଅଭିଜ୍ଞତା ପାଇଁ, ଆମେ ପରାମର୍ଶ ଦେଉଛୁ ଯେ ଆପଣ ଏକ ଅପଡେଟ୍ ବ୍ରାଉଜର୍ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ (କିମ୍ବା ଇଣ୍ଟରନେଟ୍ ଏକ୍ସପ୍ଲୋରରରେ ସୁସଙ୍ଗତତା ମୋଡ୍ ଅକ୍ଷମ କରନ୍ତୁ) |ମ meantime ିରେ ମ continued ିରେ, ନିରନ୍ତର ସମର୍ଥନ ନିଶ୍ଚିତ କରିବାକୁ, ଆମେ ଶ yles ଳୀ ଏବଂ ଜାଭାସ୍କ୍ରିପ୍ଟ ବିନା ସାଇଟ୍ ଉପସ୍ଥାପନ କରିବୁ |
ସକ୍ରିୟ ଏଷ୍ଟର୍ କିମ୍ବା ଫେନୋକ୍ସି ରେଡିକାଲ ଉପରେ ଆଧାରିତ ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ନିକଟତର ଲେବେଲିଂ ପ୍ରଣାଳୀ ଜୀବନ୍ତ କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ସବସେଲୁଲାର୍ ପ୍ରୋଟିମ୍ ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଇଣ୍ଟରାକ୍ଟରକୁ ମାନଚିତ୍ର କରିବା ପାଇଁ ବହୁଳ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ |ଅବଶ୍ୟ, ସକ୍ରିୟ ଏଷ୍ଟର୍ଗୁଡ଼ିକ କମ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳ, ଫଳସ୍ୱରୂପ ଏକ ବ୍ୟାପକ ଲେବେଲିଂ ବ୍ୟାଡ୍ୟୁସ୍ ସୃଷ୍ଟି ହୁଏ, ଏବଂ ପେରକ୍ସାଇଡ୍ ଚିକିତ୍ସା ଦ୍ ated ାରା ଉତ୍ପନ୍ନ ଫେନୋକ୍ସି ରେଡିକାଲ୍ସ ରେଡକ୍ସ ପଥରେ ବାଧା ସୃଷ୍ଟି କରିପାରେ |ଏଠାରେ ଆମେ ମିନିସୋଗ ଫଟୋସେନାଇଟାଇଜର ପ୍ରୋଟିନକୁ ଏକ ପ୍ରୋଟିନ ସହିତ ଜେନେଟିକ୍ ସଂଯୋଗ କରି ବିକଶିତ ହୋଇଥିବା ଏକ ନିକଟତମ ଲେବଲ୍ ନିର୍ଭରଶୀଳ ଫଟୋ ଆକ୍ଟିଭେସନ୍ (PDPL) ପଦ୍ଧତି ବିଷୟରେ ଜଣାଇବୁ |ନୀଳ ଆଲୋକ ଦ୍ Tr ାରା ଟ୍ରିଗର୍ ହୋଇ ଏକ୍ସପୋଜର ସମୟ ଦ୍ controlled ାରା ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ହୁଏ, ଏକକ ଅମ୍ଳଜାନ ଉତ୍ପନ୍ନ ହୁଏ ଏବଂ ତା’ପରେ ଅନିଲାଇନ୍ ପ୍ରୋବ ଦ୍ୱାରା ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶଗୁଡିକର ସ୍ପେଟିଓଟୋମପୋରାଲ୍ ସମାଧାନର ଲେବେଲିଂ ହାସଲ ହୁଏ |ଅର୍ଗାନେଲ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରୋଟୋମ ମ୍ୟାପିଂ ମାଧ୍ୟମରେ ଆମେ ଏହାର ଉଚ୍ଚ ବିଶ୍ୱସ୍ତତା ପ୍ରଦର୍ଶନ କରୁ |TurboID ସହିତ PDPL ର ପାର୍ଶ୍ compar ତୁଳନା PDPL ର ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଏବଂ ବିସ୍ତୃତ ପ୍ରୋଟୋମିକ୍ କଭରେଜ୍ ଦେଖାଏ |ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ, ଆମେ ରୋଗ ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ କୋଆକ୍ଟିଭେଟର୍ BRD4 ଏବଂ E3 ପାର୍କିନ୍ ଲିଗେଜରେ PDPL ପ୍ରୟୋଗ କରିଥିଲୁ ଏବଂ ପୂର୍ବରୁ ଅଜ୍ଞାତ ଇଣ୍ଟରାକ୍ଟର୍ ପାଇଲୁ |ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ ସ୍କ୍ରିନିଂ ଦ୍ Park ାରା, ପାର୍କିନ୍ ପାଇଁ ଦୁଇଟି ଅଜ୍ଞାତ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍, Ssu72 ଏବଂ SNW1 ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହାର ଅବକ୍ଷୟ ସର୍ବବ୍ୟାପୀ-ପ୍ରୋଟିଜୋମ୍ ପଥ ଦ୍ୱାରା ମଧ୍ୟସ୍ଥି |
ପ୍ରୋଟିନ୍ ନେଟୱାର୍କର ସଠିକ୍ ଚରିତ୍ରକରଣ ଅନେକ ମ fundamental ଳିକ ସେଲୁଲାର୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାକୁ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରେ |ତେଣୁ, ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟର ଅତ୍ୟଧିକ ସଠିକ୍ ସ୍ପାଟିଓଟୋମପୋରାଲ୍ ମ୍ୟାପିଙ୍ଗ୍ ଜ bi ବିକ ପଥ, ରୋଗ ପାଥୋଲୋଜି ଏବଂ ଥେରାପିଟିଭ୍ ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟରେ ଏହି ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟାକୁ ବ୍ୟାହତ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ମଲିକୁଲାର ଆଧାର ପ୍ରଦାନ କରିବ |ଏହି ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟରେ, ଜୀବକୋଷ କିମ୍ବା ଟିସୁରେ ସାମୟିକ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଚିହ୍ନଟ କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ପଦ୍ଧତିଗୁଡିକ ଅତ୍ୟନ୍ତ ଆବଶ୍ୟକୀୟ |Aff ତିହାସିକ ଭାବେ ପ୍ରୋଟିନର ପ୍ରୋଟିନ (POIs) ର ବାନ୍ଧୀ ଅଂଶୀଦାରମାନଙ୍କୁ ଚିହ୍ନିବା ପାଇଁ ଆଫିନିଟି ଶୁଦ୍ଧତା ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି (AP-MS) ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଛି |ପରିମାଣିକ ପ୍ରୋଟୋମିକ୍ସ ପଦ୍ଧତିର ବିକାଶ ସହିତ, Bioplex3.0 ସୃଷ୍ଟି ହେଲା, AP-MS ଉପରେ ଆଧାରିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ନେଟୱାର୍କର ସର୍ବ ବୃହତ ଡାଟାବେସ୍ |ଯଦିଓ AP-MS ଅତ୍ୟନ୍ତ ଶକ୍ତିଶାଳୀ, କାର୍ଯ୍ୟ ପ୍ରବାହରେ ସେଲ୍ ଲାଇସିସ୍ ଏବଂ ଦିଲ୍ୟୁସନ୍ ଷ୍ଟେପ୍ ଦୁର୍ବଳ ଏବଂ କ୍ଷଣସ୍ଥାୟୀ ବାନ୍ଧିବା ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପ ପ୍ରତି ପକ୍ଷପାତିତ ହୁଏ ଏବଂ ଲାଇସିସ୍ ପରବର୍ତ୍ତୀ କଳାକୃତି ପରି ପ୍ରବର୍ତ୍ତାଇଥାଏ ଯେପରିକି ଲାଇସିସ୍ ପୂର୍ବରୁ କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟାଲାଇଜେସନ୍ ଅଭାବ |
ଏହି ସମସ୍ୟାର ସମାଧାନ ପାଇଁ, କ୍ରସ୍ ଲିଙ୍କ୍ ଗ୍ରୁପ୍ ଏବଂ ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ନିକଟବର୍ତ୍ତୀ ଲେବେଲିଂ (PL) ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ସହିତ ଅପ୍ରାକୃତିକ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ (UAA) ବିକଶିତ ହୋଇଛି |ଯଦିଓ UAA ପଦ୍ଧତି ଅନେକ ପରିସ୍ଥିତିରେ ସଫଳତାର ସହିତ ପ୍ରୟୋଗ ହୋଇଛି ଏବଂ ସିଧାସଳଖ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଆଡେସିଭ୍ ବିଷୟରେ ସୂଚନା ପ୍ରଦାନ କରିଥାଏ, ତଥାପି UAA ସନ୍ନିବେଶ ସାଇଟର ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ ଆବଶ୍ୟକ |ସବୁଠାରୁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ କଥା ହେଉଛି, ଏହା ଏକ ଷ୍ଟୋଇଚିଓମେଟ୍ରିକ୍ ଲେବେଲିଂ ପଦ୍ଧତି ଯେଉଁଥିରେ ଲେବଲ୍ ଇଭେଣ୍ଟଗୁଡିକର ଏକ ଅନୁକ୍ରମଣିକା ଓଲଟା ଅଭାବ |ଏହାର ବିପରୀତରେ, BioID ପଦ୍ଧତି ପରି ଏନଜାଇମାଟିକ୍ ପିଏଲ୍ ପଦ୍ଧତିଗୁଡିକ ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ ବାୟୋଟିନ୍ ଲିଗେଜ୍ କୁ POI7 ରେ ଫ୍ୟୁଜ୍ କରିଥାଏ, ଯାହା ପରବର୍ତ୍ତୀ ସମୟରେ ବାୟୋଟିନକୁ ସକ୍ରିୟ କରି ଏକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳ ବାୟୋଟିନିଲ୍-ଏମ୍ପି ଏଷ୍ଟର ମଧ୍ୟବର୍ତ୍ତୀ ଗଠନ କରିଥାଏ |ଏନ୍ଜାଇମ୍ ଏହିପରି ଏକ ସକ୍ରିୟ ବାୟୋଟିନ୍ “କ୍ଲାଉଡ୍” କୁ କାଟାଲାଇଜ୍ କରେ ଏବଂ ପ୍ରକ୍ସିମାଲ୍ ଲାଇସେନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶକୁ ଲେବଲ୍ କରେ |ତଥାପି, BioID ଏକ ପର୍ଯ୍ୟାପ୍ତ ଲେବଲ୍ ସଙ୍କେତ ପାଇବା ପାଇଁ 12 ଘଣ୍ଟାରୁ ଅଧିକ ସମୟ ଆବଶ୍ୟକ କରେ, ଯାହା ସାମୟିକ ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ ସହିତ ଏହାର ବ୍ୟବହାରକୁ ରୋକିଥାଏ |ଖମୀର ପ୍ରଦର୍ଶନ ଉପରେ ଆଧାରିତ ନିର୍ଦ୍ଦେଶିତ ବିବର୍ତ୍ତନ ବ୍ୟବହାର କରି, TurboID ଅଧିକ ପ୍ରଭାବଶାଳୀ ହେବା ପାଇଁ BioID ଉପରେ ଡିଜାଇନ୍ କରାଯାଇଥିଲା, 10 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ବାୟୋଟିନ୍ ସହିତ ଦକ୍ଷ ଲେବେଲିଂକୁ ଅନୁମତି ଦେଇ ଅଧିକ ଗତିଶୀଳ ପ୍ରକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକୁ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦେଲା |ଯେହେତୁ TurboID ଅତ୍ୟଧିକ ସକ୍ରିୟ ଏବଂ ନିମ୍ନ ସ୍ତରର ଲେବେଲିଂ ପାଇଁ ଏଣ୍ଡୋଜେନସ୍ ବାୟୋଟିନ୍ ସ୍ତର ଯଥେଷ୍ଟ, ବ୍ୟାକଗ୍ରାଉଣ୍ଡ ଲେବେଲିଂ ଏକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ସମସ୍ୟା ହୋଇଯାଏ ଯେତେବେଳେ ଏକ୍ସୋଜେନସ୍ ବାୟୋଟିନ୍ ଯୋଗ ଦ୍ୱାରା ଉଚ୍ଚ ବର୍ଦ୍ଧିତ ଏବଂ ଟାଇମଡ୍ ଲେବେଲିଂ ଆବଶ୍ୟକ ହୁଏ |ଏହା ସହିତ, ସକ୍ରିୟ ଏଷ୍ଟର୍ଗୁଡ଼ିକ ଖରାପ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳ (t1 / 2 ~ 5 ମିନିଟ୍), ଯାହା ଏକ ବୃହତ ଲେବେଲିଂ ବ୍ୟାଡ୍ୟୁସକୁ ନେଇପାରେ, ବିଶେଷତ bi ବାୟୋଟିନ୍ ସହିତ ପଡୋଶୀ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପରିପୃଷ୍ଟ ହେବା ପରେ | ଫେନୋଲ୍ ରେଡିକାଲ୍ ଏବଂ ଏକ ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଲେବଲ୍ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ 9,10। ସେଲ୍ୟୁଲାର୍ ପ୍ରକ୍ରିୟା |
ଏହିପରି, ସେଲ୍ୟୁଲାର୍ ପଥକୁ ବିଶେଷ ବାଧା ନ ଦେଇ ଉଚ୍ଚ ସ୍ଥାନିକ ଏବଂ ସାମୟିକ ସଠିକତା ସହିତ ଅଧିକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳ ଲେବଲ୍-ରେଡିୟସ୍ ଦମନ ପ୍ରଜାତି ସୃଷ୍ଟି କରିବାରେ ସକ୍ଷମ ଏକ ନୂତନ ପଦ୍ଧତି ବିଦ୍ୟମାନ ପଦ୍ଧତିଗୁଡିକ ପାଇଁ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଯୋଗଦାନ ହେବ | ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳ ପ୍ରଜାତି ମଧ୍ୟରେ, ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ଏହାର ସ୍ୱଳ୍ପ ଜୀବନକାଳ ଏବଂ ସୀମିତ ବିସ୍ତାର ବ୍ୟାପାର (କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ t1 / 2 <0.6 µs) ହେତୁ ଆମ ଦୃଷ୍ଟି ଆକର୍ଷଣ କଲା | ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳ ପ୍ରଜାତି ମଧ୍ୟରେ, ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ଏହାର ସ୍ୱଳ୍ପ ଜୀବନକାଳ ଏବଂ ସୀମିତ ବିସ୍ତାର ବ୍ୟାପାର (କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ t1 / 2 <0.6 µs) ହେତୁ ଆମ ଦୃଷ୍ଟି ଆକର୍ଷଣ କଲା | С адан активных форм наше внимание привлек синглетный К адод из-за его короткого времени жизни и ограниченного чидуса дифузии (t1 / 2 <0,6 мсек в клетках) 13। ସକ୍ରିୟ ଫର୍ମଗୁଡିକ ମଧ୍ୟରେ, ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ଏହାର ସ୍ୱଳ୍ପ ଜୀବନକାଳ ଏବଂ ସୀମିତ ବିସ୍ତାର ବ୍ୟାପାର (କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ t1 / 2 <0.6 µs) ହେତୁ ଆମ ଦୃଷ୍ଟି ଆକର୍ଷଣ କରିଥିଲା ​​|在 活性 物质 1 1 1 1 1/1 <0.6 µs） 而 引起 我们 注意 注意 13。 1/2 <0.6 µs） 而 引起 了 注意 注意 13 | С адян активных форм наше внимание привлекает синглетный Кизод из-за его короткого времени жизни и ограниченного чидуса дифузии (t1 / 2 <0,6 мк в клетках)। ସକ୍ରିୟ ଫର୍ମଗୁଡିକ ମଧ୍ୟରେ, ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ଏହାର ସ୍ୱଳ୍ପ ଜୀବନକାଳ ଏବଂ ସୀମିତ ବିସ୍ତାର ବ୍ୟାପାର (କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ t1 / 2 <0.6 μs) ହେତୁ ଆମ ଦୃଷ୍ଟି ଆକର୍ଷଣ କରେ |ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ମିଥୋନିନ୍, ଟାଇରୋସିନ୍, ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ଏବଂ ଟ୍ରାଇପଟୋଫାନକୁ ଅନିୟମିତ ଭାବରେ ଅକ୍ସିଡାଇଜ୍ କରିଥିବାର ଜଣାଯାଇଛି, ଯାହା ଆମିନ କିମ୍ବା ଥାଇଲ ଆଧାରିତ ପ୍ରୋବ ସହିତ ସଂଲଗ୍ନ ହେବା ପାଇଁ ଏହାକୁ ପୋଲାର 14,15 କରିଦିଏ |ଯଦିଓ ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ସବ୍ସେଲୁଲାର୍ କମ୍ପାର୍ଟମେଣ୍ଟ୍ RNA କୁ ଲେବଲ୍ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଛି, ଏଣ୍ଡୋଜେନସ୍ POI ନିକଟତର ମାର୍କରଗୁଡିକ ପୁନ ur ସ୍ଥାପିତ କରିବା ପାଇଁ ରଣନୀତି ଅନ୍ୱେଷଣ ହୋଇ ରହିଛି |ଏଠାରେ, ଆମେ ଫଟୋ ଆକ୍ଟିଭେସନ୍-ନିର୍ଭରଶୀଳ ନିକଟତର ଲେବଲ୍ (PDPL) ନାମକ ଏକ ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ଉପସ୍ଥାପନ କରୁ, ଯେଉଁଠାରେ ଆମେ ଏକ ମିନିସୋଗ୍ ଫଟୋସେନାଇଟାଇଜର୍ ସହିତ ଫ୍ୟୁଜ୍ ହୋଇଥିବା POI କୁ ଆଲୋକିତ କରିବା ପାଇଁ ନୀଳ ଆଲୋକ ବ୍ୟବହାର କରୁ ଏବଂ ପ୍ରକ୍ସିମାଲ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶକୁ ଅକ୍ସିଡାଇଜ୍ କରିବା ପାଇଁ ଏକକ ଅମ୍ଳଜାନ ଉତ୍ପାଦନକୁ ଟ୍ରିଗର୍ କରିଥାଉ, ତା’ପରେ ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନକୁ ଅକ୍ସିଡାଇଜ୍ କରିବା ପାଇଁ ଆମିନ ଧାରଣ କରିଥିବା ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡିକ | ମଧ୍ୟବର୍ତ୍ତୀ ଜୀବକୋଷ |।ଟ୍ୟାଗ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାକୁ ବ imize ାଇବା ପାଇଁ ଆମେ ଏକ ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନର ଏକ ଗୋଷ୍ଠୀ ପରୀକ୍ଷା କଲୁ ଏବଂ ଏକ ଖୋଲା ପ୍ରୋଟୋମିକ୍ସ ୱାର୍କଫ୍ଲୋ ବ୍ୟବହାର କରି ରୂପାନ୍ତର ସାଇଟଗୁଡିକ ଚିହ୍ନଟ କଲୁ |TurboID ସହିତ PDPL ର ପାର୍ଶ୍ compar ତୁଳନା PDPL ର ଏକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଏବଂ ବିସ୍ତୃତ ପ୍ରୋଟୋମିକ୍ କଭରେଜ୍ ଦେଖାଏ |ସବ୍ସେଲୁଲାର୍ ପ୍ରୋଟୋମର ଅର୍ଗାନେଲ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ମାର୍କର ଏବଂ କର୍କଟ ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଏପିଜେନେଟିକ୍ ନିୟାମକ ପ୍ରୋଟିନ୍ BRD4 ଏବଂ ପାର୍କିନ୍ସନ୍ ରୋଗ ସହ ଜଡିତ E3 ଲିଗେଜ୍ ପାର୍କିନ୍ ପାଇଁ ବାନ୍ଧୀ ଅଂଶୀଦାରମାନଙ୍କର ସାଧାରଣ ପ୍ରୋଟିମ୍ ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ ଆମେ ଏହି ପଦ୍ଧତି ପ୍ରୟୋଗ କରିଥିଲୁ, ଯାହା ପ୍ରୋଟିନ୍ ର ଏକ ଜଣାଶୁଣା ଏବଂ ଏକ ଅଜ୍ଞାତ ନେଟୱାର୍କକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲା ​​| ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା।ବୃହତ ପ୍ରୋଟିନ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସରେ E3 ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଚିହ୍ନିବା ପାଇଁ PDPL ର କ୍ଷମତା ଏକ ସ୍ଥିତିକୁ ପ୍ରତିପାଦିତ କରେ ଯେଉଁଠାରେ ପରୋକ୍ଷ ବାଇଣ୍ଡରର ସ୍ୱୀକୃତି ଆବଶ୍ୟକ |ଉବିକ୍ୟୁଇଟିନେସନ୍-ପ୍ରୋଟିଜୋମ୍ ଦ୍ i ାରା ମଧ୍ୟସ୍ଥ ହୋଇଥିବା ଦୁଇଟି ଅଜ୍ଞାତ ପାର୍କିନ୍ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ସ୍ଥିତିକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଛି |
ଫୋଟୋଡାଇନାମିକ୍ ଥେରାପି (PDT) 19 ଏବଂ କ୍ରୋମୋଫୋର-ସହାୟକ ଲେଜର ନିଷ୍କ୍ରିୟକରଣ (CALI) 20, ଯେଉଁଥିରେ ଫଟୋସେନାଇଟିଜର୍ ସହିତ ହାଲୁକା ବିକିରଣ ଏକକ ଅମ୍ଳଜାନ ସୃଷ୍ଟି କରେ, ଲକ୍ଷ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ନିଷ୍କ୍ରିୟ କରିପାରେ କିମ୍ବା କୋଷ ମୃତ୍ୟୁ ଘଟାଇପାରେ |ଯେହେତୁ ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ପ୍ରାୟ 70 nm ର ଏକ ତତ୍ତ୍ୱଗତ ବିସ୍ତାର ଦୂରତା ସହିତ ଏକ ଅତ୍ୟଧିକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳ ପଦାର୍ଥ, ତେଣୁ ଫଟୋସେନାଇଟାଇଜର ଚାରିପାଖରେ ସୀମିତ ଅକ୍ସିଡେସନ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରାଯାଇପାରିବ |ଏହି ଧାରଣା ଉପରେ ଆଧାର କରି, ଜୀବକୋଷରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସଗୁଡିକର ଘନିଷ୍ଠ ଲେବଲ୍ ହାସଲ କରିବାକୁ ଆମେ ଏକକ ଅମ୍ଳଜାନ ବ୍ୟବହାର କରିବାକୁ ସ୍ଥିର କଲୁ |ଚାରୋଟି କାର୍ଯ୍ୟ ପୂରଣ କରିବା ପାଇଁ ଆମେ ଏକ PDPL କେମୋପ୍ରୋଟେମିକ୍ ପଦ୍ଧତିକୁ ବିକଶିତ କରିଛୁ:()) ଆଲୋକ ଆରମ୍ଭ ଉପରେ ସମୟ-ସମାଧାନ ଲେବଲ୍ ପ୍ରଦାନ;()) ପରିବର୍ତ୍ତନ ଦ୍ (ାରା ()) ପୃଷ୍ଠଭୂମି ହ୍ରାସ କରିବା ପାଇଁ ଏଣ୍ଡୋଜେନସ୍ କୋଫାକ୍ଟର (ଯେପରିକି ବାୟୋଟିନ୍) ବ୍ୟବହାର କରିବା ଠାରୁ ଦୂରେଇ ରୁହନ୍ତୁ, କିମ୍ବା ପରିବେଶ ଚାପରେ କୋଷର ଏକ୍ସପୋଜରକୁ କମ୍ କରିବା ପାଇଁ ଅତ୍ୟଧିକ ବିଚଳିତ ଏକ୍ସୋଜେନସ୍ ରିଜେଣ୍ଟସ୍ (ଯେପରିକି ପେରକ୍ସାଇଡ୍) ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |
ଛୋଟ ସେଲ୍ୟୁଲାର୍ ଓଜନ ଫ୍ଲୋରୋଫୋରସ୍ (ଯଥା ଗୋଲାପ ବେଙ୍ଗାଲ୍, ମିଥାଇଲିନ ବ୍ଲୁ) 22 ଏବଂ ଜେନେଟିକ୍ ଏନକୋଡେଡ୍ ଛୋଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ (ଯଥା ମିନିସୋଗ୍, କିଲର୍ ରେଡ୍) 23 ସହିତ ଫଟୋସେନାଇଟିଜରକୁ ଦୁଇଟି ଶ୍ରେଣୀରେ ବିଭକ୍ତ କରାଯାଇପାରେ |ଏକ ମଡ୍ୟୁଲାର୍ ଡିଜାଇନ୍ ହାସଲ କରିବାକୁ, ଆମେ POI24,25 (ଚିତ୍ର 1a) ରେ ଫଟୋସେନାଇଟାଇଜର୍ (PS) ପ୍ରୋଟିନ୍ ଯୋଗ କରି ପ୍ରଥମ ପି generation ଼ିର PDPL ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ବିକଶିତ କରିଛୁ |ଯେତେବେଳେ ନୀଳ ଆଲୋକ ସହିତ ବିକିରଣ ହୁଏ, ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ପ୍ରକ୍ସିମାଲ୍ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଫିଲିକ୍ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶକୁ ଅକ୍ସିଡାଇଜ୍ କରେ, ଫଳସ୍ୱରୂପ ଏକ ଅମ୍ପୋଲଙ୍ଗ ପୋଲାରିଟି ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫିଲିକ୍ ଅଟେ ଏବଂ ଆମିନ ପ୍ରୋବ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଫାଇଲ୍ସ ସହିତ ଅଧିକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କରିପାରେ |ରସାୟନକୁ କ୍ଲିକ୍ କରିବାକୁ ଏବଂ LC / MS / MS ବର୍ଣ୍ଣକରଣ ପାଇଁ ତଳକୁ ଟାଣିବାକୁ ଏକ ଆଲକାଇନ୍ ହ୍ୟାଣ୍ଡଲ୍ ସହିତ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରାଯାଇଛି |
ମିନିସୋଗ୍ ଦ୍ୱାରା ମଧ୍ୟସ୍ଥ ପ୍ରୋଟିନ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସଗୁଡିକର ଲେବେଲିଂର ସ୍କିମେଟିକ୍ ଚିତ୍ରଣ |ଯେତେବେଳେ ନୀଳ ଆଲୋକର ସଂସ୍ପର୍ଶରେ ଆସେ, ମିନିସୋଗ୍- POI ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଏକକ ଅମ୍ଳଜାନ ସୃଷ୍ଟି କରନ୍ତି, ଯାହା ପାରସ୍ପରିକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରିଥାଏ କିନ୍ତୁ ବାନ୍ଧୁଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ନୁହେଁ |ଫଟୋକ୍ସିଡେସନ୍ ର ମଧ୍ୟବର୍ତ୍ତୀ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ କୋଭାଲାଣ୍ଟ ଆଡକ୍ଟସ୍ ଗଠନ ପାଇଁ ଆମିନ ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନର ରିଲେ ଲେବଲ୍ ଦ୍ୱାରା ବାଧା ପ୍ରାପ୍ତ ହୁଏ |ରସାୟନ ବିଜ୍ଞାନ ଅନୁସନ୍ଧାନରେ ଥିବା ଆଲକିନିଲ୍ ଗୋଷ୍ଠୀ LC-MS / MS ପରିମାଣ ଦ୍ୱାରା ପଲ୍-ଡାଉନ୍ ଦ୍ୱାରା ସମୃଦ୍ଧ ପାଇଁ ରସାୟନ ବିଜ୍ଞାନକୁ କ୍ଲିକ୍ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ |b ଆମିନ ଅନୁସନ୍ଧାନର ରାସାୟନିକ ଗଠନ 1-4 |c ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଲୋକାଲାଇଜଡ୍ ମିନିଏସୋଗ୍-ମଧ୍ୟସ୍ଥ ପ୍ରୋଟୋମିକ୍ ମାର୍କରର ପ୍ରତିନିଧୀ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ଜେଲ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ 1-4 ପ୍ରୋବ ଏବଂ ଜେଲ୍ ଡେନସାଇଟୋମେଟ୍ରୀ ଉପରେ ଆଧାର କରି ଆପେକ୍ଷିକ ପରିମାଣ ବ୍ୟବହାର କରିଥାଏ |ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନର ସିଗନାଲ୍-ଟୁ-ବ୍ୟାକଗ୍ରାଉଣ୍ଡ ଅନୁପାତକୁ ନୀଳ ଆଲୋକକୁ ବାଦ ଦେଇ କିମ୍ବା HES293T କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ମିନିସୋଗ୍ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ବିନା ବ୍ୟବହାର କରି ନକାରାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ପରୀକ୍ଷଣ ବ୍ୟବହାର କରି ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା |n = 2 ଜ olog ବଗତ ଭାବରେ ସ୍ independent ାଧୀନ ନମୁନା |ପ୍ରତ୍ୟେକ ବିନ୍ଦୁ ଏକ ଜ ological ବିକ ପ୍ରତିକୃତିକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ |d ପରି PDPL ଉପାଦାନଗୁଡ଼ିକର ଉପସ୍ଥିତି କିମ୍ବା ଅନୁପସ୍ଥିତିରେ ଅପ୍ଟିମାଇଜ୍ ପ୍ରୋବ 3 ବ୍ୟବହାର କରି PDPL ର ପ୍ରତିନିଧୀ ଚିହ୍ନଟ ଏବଂ ପରିମାଣ |n = 3 ଜ olog ବଗତ ଭାବରେ ସ୍ independent ାଧୀନ ନମୁନା |ପ୍ରତ୍ୟେକ ବିନ୍ଦୁ ଏକ ଜ ological ବିକ ପ୍ରତିକୃତିକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ |ସେଣ୍ଟର୍ ଲାଇନ୍ ଏବଂ ୱିସ୍କର୍ ଗୁଡିକ ହାରାହାରି ଏବଂ ± ମାନକ ବିଚ୍ୟୁତିକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ |ସିବିବି: କୁମାସି ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ ନୀଳ |e ଦୂର-ଲାଲ୍ Si-DMA ଦାଗ ସହିତ ଏକକ ଅମ୍ଳଜାନର କନଫୋକାଲ୍ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ |ମାପ ଦଣ୍ଡ: 10 µ ମି।ସମାନ ଫଳାଫଳ ସହିତ ଅନ୍ତତ least ପକ୍ଷେ ଦୁଇଥର ଜେଲ୍ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ ଏବଂ କନଫୋକାଲ୍ ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ ସ୍ ently ାଧୀନ ଭାବରେ ପୁନରାବୃତ୍ତି କରାଯାଇଥିଲା |
ଆମେ ପ୍ରଥମେ ପରିପକ୍ୱ ଫଟୋସେନିଟାଇଜର୍ସ miniSOG26 ଏବଂ KillerRed23 ର ଦକ୍ଷତାକୁ ପରୀକ୍ଷା କରିଥିଲୁ, HEK293T ରେ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଥିଲା, ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ ଭାବରେ ପ୍ରୋଟିମର ପ୍ରୋପାର୍ଜିଲାମାଇନ୍ ଲେବେଲିଂକୁ ମଧ୍ୟସ୍ଥ କରିବା ପାଇଁ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1a) |ଜେଲ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ମିନିଏସୋଗ ଏବଂ ନୀଳ ଆଲୋକ ବିକିରଣ ବ୍ୟବହାର କରି ପୁରା ପ୍ରୋଟିମ୍ ଲେବେଲିଂ ହାସଲ କରାଯାଇଥିଲା, ଯେତେବେଳେ କି କିଲର୍ ରେଡ୍ ସହିତ କ visible ଣସି ଦୃଶ୍ୟମାନ ଲେବଲ୍ ଉତ୍ପାଦ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇନଥିଲା |ସିଗନାଲ୍-ଟୁ-ବ୍ୟାକଗ୍ରାଉଣ୍ଡ ଅନୁପାତରେ ଉନ୍ନତି ଆଣିବା ପାଇଁ, ଆମେ ପରେ ଅନିଲାଇନ୍ (and ଏବଂ)), ପ୍ରୋପିଲାମାଇନ୍ (୨), କିମ୍ବା ବେନଜିଲାମାଇନ୍ ()) ଧାରଣ କରିଥିବା ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନର ଏକ ସେଟ୍ ପରୀକ୍ଷା କଲୁ |ଆମେ ଦେଖିଲୁ ଯେ HEK293T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ କ blue ଣସି ନୀଳ ଆଲୋକ ତୁଳନାରେ ଅଧିକ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ସଙ୍କେତ ଥିଲା, ସମ୍ଭବତ the ଏଣ୍ଡୋଜେନସ୍ ରିବୋଫ୍ଲାଭିନ୍ ଫଟୋସେନାଇଟାଇଜର୍, ଫ୍ଲାଭିନ ମୋନୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ (FMN) 27 ହେତୁ | ଅନିଲାଇନ୍-ଆଧାରିତ ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ 1 ଏବଂ 3 ଉତ୍ତମ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ପ୍ରଦାନ କଲା, HEK293T ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆରେ ମିନିଏସୋଗକୁ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ପ୍ରୋବ 3 ପାଇଁ ସିଗନାଲରେ 8 ଗୁଣା ବୃଦ୍ଧି ପ୍ରଦର୍ଶନ କରୁଥିବାବେଳେ RNA- ଲେବେଲିଂ ପ୍ରଣାଳୀରେ ବ୍ୟବହୃତ ପ୍ରୋବ 2 କେବଳ ~ 2.5- ପ୍ରଦର୍ଶିତ କରେ | ଫୋଲ୍ଡ ସିଗନାଲ ବୃଦ୍ଧି, ସମ୍ଭବତ R RNA ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଧ୍ୟରେ ଭିନ୍ନ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳତା ପସନ୍ଦ (ଚିତ୍ର 1 ବି, ଗ) | ଅନିଲାଇନ୍-ଆଧାରିତ ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ 1 ଏବଂ 3 ଉତ୍ତମ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ପ୍ରଦାନ କଲା, HEK293T ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆରେ ମିନିଏସୋଗକୁ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ପ୍ରୋବ 3 ପାଇଁ ସିଗନାଲରେ 8 ଗୁଣା ବୃଦ୍ଧି ପ୍ରଦର୍ଶନ କରୁଥିବାବେଳେ RNA- ଲେବେଲିଂ ପ୍ରଣାଳୀରେ ବ୍ୟବହୃତ ପ୍ରୋବ 2 କେବଳ ~ 2.5- ପ୍ରଦର୍ଶିତ କରେ | ଫୋଲ୍ଡ ସିଗନାଲ ବୃଦ୍ଧି, ସମ୍ଭବତ R RNA ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଧ୍ୟରେ ଭିନ୍ନ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳତା ପସନ୍ଦ (ଚିତ୍ର 1 ବି, ଗ) |ଅନିଲାଇନ୍-ଆଧାରିତ ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ 1 ଏବଂ 3 ଉନ୍ନତ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଦେଖାଇଲା: HEK293T, ଯାହା ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆରେ ମିନିଏସୋଗିକୁ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ଦର୍ଶାଏ, ପ୍ରୋବ 3 ପାଇଁ ସିଗନାଲର 8 ଗୁଣା ବୃଦ୍ଧି ଦେଖାଏ, ଯେତେବେଳେ CAP-seq RNA ଲେବେଲିଂ ପଦ୍ଧତିରେ ବ୍ୟବହୃତ ପ୍ରୋବ 2 | ~ 2.5 ଗୁଣା ସଙ୍କେତ ବୃଦ୍ଧି ଦେଖାଏ, ବୋଧହୁଏ RNA ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଧ୍ୟରେ ଭିନ୍ନ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳତା ପସନ୍ଦ (ଚିତ୍ର 1 ବି, ଗ) |HEK293T 在 线粒体 表达 表达 miniSOG ， 探针 3 的 增加> 8 倍 ， 用于 RNA 标记 AP CAP-seq 的 探针 2 仅 显示 ~ 2.5- 倍 信号 由于 由于 由于 由于 RNA 和 蛋白质 之间 b b b b b b 1b ， c）Min og 的 探针 1 和 3 具有 更 的 ， hek293t 在 粒 体 表达 minisog ， 探针 3 的 增加 增加> 8 倍 而 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 - 倍 信号 增加 ， 可能 由于 RNA |ଅନିଲାଇନ୍-ଆଧାରିତ ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ 1 ଏବଂ 3 ର ଉତ୍ତମ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଥିଲା, HEK293T ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆରେ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ମିନିସୋଗ୍ ପ୍ରକାଶ କରିଥିଲା, ଏବଂ ପ୍ରୋବ 3 ର ସଙ୍କେତରେ 8 ଗୁଣା ବୃଦ୍ଧି ଘଟିଥିବାବେଳେ CAP-seq RNA ଲେବେଲିଂ ପଦ୍ଧତି ପାଇଁ ପ୍ରୋବ 2 କେବଳ ~ 2.5 ଗୁଣ ବୃଦ୍ଧି କରିଥିଲା ​​|ସଙ୍କେତରେ, ବୋଧହୁଏ RNA ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଧ୍ୟରେ ଭିନ୍ନ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପସନ୍ଦ (ଚିତ୍ର 1 ବି, ଗ) |ଏଥିସହ, ପ୍ରୋବ 3 ଆଇସୋମର୍ ଏବଂ ହାଇଡ୍ରାଜାଇନ୍ ପ୍ରୋବ (ପ୍ରୋବ 5, 6, 7) ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ପ୍ରୋବ 3 (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 1 ବି, ଗ) ର ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲା ​​|ସେହିଭଳି, ଇନ୍-ଜେଲ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ବିଶ୍ଳେଷଣରେ ଅନ୍ୟ ଅପ୍ଟିମାଇଜଡ୍ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ପାରାମିଟରଗୁଡିକ ପ୍ରକାଶ ପାଇଲା: ବିକିରଣ ତରଙ୍ଗଦ eng ର୍ଘ୍ୟ (460 nm), ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ ଏକାଗ୍ରତା (1 ମି।), ଏବଂ ବିକିରଣ ସମୟ (20 ମିନିଟ୍) (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 2a - c) |PDPL ପ୍ରୋଟୋକଲରେ ଯେକ any ଣସି ଉପାଦାନ କିମ୍ବା ପଦକ୍ଷେପକୁ ଛାଡିଦେଲେ ପୃଷ୍ଠଭୂମିରେ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ସଙ୍କେତ ଓଲଟପାଲଟ ହେଲା (ଚିତ୍ର 1d) |ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ, ସୋଡିୟମ୍ ଆଜାଇଡ୍ କିମ୍ବା ଟ୍ରୋଲକ୍ସର ଉପସ୍ଥିତିରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଲେବେଲିଂ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ ପାଇଥିଲା, ଯାହା ଏକକ ଅମ୍ଳଜାନକୁ ଲିଭାଇଥାଏ |D2O ର ଉପସ୍ଥିତି, ଯାହା ଏକକ ଅମ୍ଳଜାନକୁ ସ୍ଥିର କରିବା ପାଇଁ ଜଣାଶୁଣା, ଲେବେଲିଂ ସଙ୍କେତକୁ ବ ances ାଇଥାଏ |ଲେବେଲିଂରେ ଅନ୍ୟ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳ ଅମ୍ଳଜାନ ପ୍ରଜାତିର ଅବଦାନ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବାକୁ ଯଥାକ୍ରମେ 18, 29 ରେ ହାଇଡ୍ରକ୍ସିଲ୍ ଏବଂ ସୁପରକ୍ସାଇଡ୍ ରେଡିକାଲ୍ ସ୍କାଭେଞ୍ଜର ପ୍ରତିଷ୍ଠା ପାଇଁ ମ୍ୟାନିଟୋଲ୍ ଏବଂ ଭିଟାମିନ୍ ସି ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା, କିନ୍ତୁ ଲେବେଲିଂ ହ୍ରାସ କରିବାରେ ତାହା ମିଳିଲା ନାହିଁ |H2O2 ର ଯୋଗ, କିନ୍ତୁ ଆଲୋକିତ ନୁହେଁ, ଲେବଲ୍ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 3a) ରେ ପରିଣତ ହେଲା ନାହିଁ |Si-DMA ଅନୁସନ୍ଧାନ ସହିତ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ HEK293T-miniSOG ତାରରେ ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନର ଉପସ୍ଥିତି ନିଶ୍ଚିତ କରିଛି, କିନ୍ତୁ ମୂଳ HEK293T ତାରରେ ନୁହେଁ |ଏହା ସହିତ, mitoSOX ରେଡ୍ ଆଲୋକିତ ହେବା ପରେ ସୁପରକ୍ସାଇଡ୍ ଉତ୍ପାଦନ ଚିହ୍ନଟ କରିପାରିଲା ନାହିଁ (ଚିତ୍ର 1e ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡ଼ିମ୍। 3 ବି) 30. ଏହି ତଥ୍ୟ ଦୃ strongly ଭାବରେ ସୂଚିତ କରେ ଯେ ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ହେଉଛି ମୁଖ୍ୟ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳ ଅମ୍ଳଜାନ ପ୍ରଜାତି ଯାହା ପରବର୍ତ୍ତୀ ପ୍ରୋଟୋମିକ୍ ଲେବେଲିଂ ପାଇଁ ଦାୟୀ |PDPL ର ସାଇଟୋଟକ୍ସାଇସିଟି ନୀଳ ଆଲୋକ ବିକିରଣ ଏବଂ ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ ସହିତ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ କ significant ଣସି ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ସାଇଟୋଟକ୍ସାଇସିଟି ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇନଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4a) |
ଲେବେଲିଂ ମେକାନିଜମକୁ ଅଧ୍ୟୟନ କରିବା ଏବଂ LC-MS / MS ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରୋଟିନ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସଗୁଡିକର ପ୍ରୋଟୋମିକ୍ ଚିହ୍ନଟକୁ ସକ୍ଷମ କରିବା ପାଇଁ, ଆମକୁ ପ୍ରଥମେ କେଉଁ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ସଂଶୋଧିତ ହୋଇଛି ଏବଂ ପ୍ରୋବ ଲେବଲ୍ ର ଡେଲଟା ମାସ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାକୁ ପଡିବ |ମିଥୋନିନ୍, ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍, ଟ୍ରାଇପଟୋଫାନ୍ ଏବଂ ଟାଇରୋସିନ୍ ଏକକ ଅମ୍ଳଜାନ 14,15 ଦ୍ୱାରା ପରିବର୍ତ୍ତିତ ହୋଇଥିବା ଜଣାଯାଇଛି |ଆମେ TOF-ABPP31 ୱାର୍କଫ୍ଲୋକୁ MSFragger32 ଉପରେ ଆଧାର କରି ଫ୍ରାଗପାଇପ୍ ଗଣନା ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ଦ୍ୱାରା ପ୍ରଦତ୍ତ ନିରପେକ୍ଷ ଖୋଲା ସନ୍ଧାନ ସହିତ ଏକୀକୃତ କରୁ |ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ରୂପାନ୍ତରଣ ଏବଂ ରାସାୟନିକ ପ୍ରୋବ ଲେବେଲିଂ ପରେ, ଏକ କ୍ଲିଭେବଲ୍ ଲିଙ୍କର୍ ଥିବା ବାୟୋଟିନ୍ ହ୍ରାସ ଲେବଲ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ରସାୟନ ବିଜ୍ଞାନ କ୍ଲିକ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପରେ ନିଉଟ୍ରାଭିଡିନ ଷ୍ଟ୍ରେଚ୍ ଏବଂ ଟ୍ରାଇପିସିନ୍ ହଜମ ହୋଇଥିଲା |ସଂଶୋଧିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍, ତଥାପି ରଜନୀ ସହିତ ବନ୍ଧା, LC-MS / MS ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଚିତ୍ରକଳା କରାଯାଇଥିଲା (ଚିତ୍ର 2a ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡାଟା 1) |50 ରୁ ଅଧିକ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମାନଚିତ୍ର (PSM) ମ୍ୟାଚ୍ ତାଲିକାଭୁକ୍ତ (ଚିତ୍ର 2 ବି) ସହିତ ପ୍ରୋଟିମ୍ରେ ବହୁ ସଂଖ୍ୟକ ପରିବର୍ତ୍ତନ ଘଟିଥିଲା ​​|ଆଶ୍ଚର୍ଯ୍ୟର କଥା, ଆମେ କେବଳ ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ର ପରିବର୍ତ୍ତନକୁ ଦେଖିଲୁ, ବୋଧହୁଏ ଅନ୍ୟ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ଅପେକ୍ଷା ଅନିଲାଇନ୍ ପ୍ରୋବ ପ୍ରତି ଅକ୍ସିଡାଇଜଡ୍ ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ର ଅଧିକ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳତା ହେତୁ |ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ଦ୍ hist ାରା ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ଅକ୍ସିଡେସନ୍ ର ପ୍ରକାଶିତ ପ୍ରଣାଳୀ ଅନୁଯାୟୀ, +229 Da ର ପ୍ରସ୍ତାବିତ ଡେଲ୍ଟା-ମାସ୍ ଗଠନ ଦୁଇଟି ଅକ୍ସିଡେସନ୍ ପରେ 2-ଅକ୍ସୋ-ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ସହିତ ପ୍ରୋବ 3 ର ଯୋଗ ସହିତ ଅନୁରୂପ ଥିବାବେଳେ +247 Da ହେଉଛି ହାଇଡ୍ରୋଲାଇସିସ୍ ଉତ୍ପାଦ | +229 ଡା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 5) |MS2 ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମର ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ଖଣ୍ଡ ଆୟନ (y ଏବଂ b) (ଚିତ୍ର 2c) ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରି ଅଧିକାଂଶ y ଏବଂ b ଆୟନର ପରିଚୟର ଏକ ଉଚ୍ଚ ବିଶ୍ୱସନୀୟତା ଦେଖାଇଲା |PDPL- ରୂପାନ୍ତରିତ ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ସର ସ୍ଥାନୀୟ କ୍ରମର ପ୍ରସଙ୍ଗ ବିଶ୍ଳେଷଣ small 1 ପଦବୀରେ ଛୋଟ ହାଇଡ୍ରୋଫୋବିକ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ପାଇଁ ଏକ ମଧ୍ୟମ ମୋଟିଫ୍ ପସନ୍ଦ ପ୍ରକାଶ କଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4b) |ହାରାହାରି, ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରତି 1.4 ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଏହି ମାର୍କରଗୁଡିକର ସାଇଟଗୁଡିକ ଦ୍ରବଣୀୟ ଆକ୍ସେସିବଲ୍ ଭୂପୃଷ୍ଠ (SASA) ଏବଂ ଆପେକ୍ଷିକ ଦ୍ରବଣ ଉପଲବ୍ଧତା (RSA) ବିଶ୍ଳେଷଣ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 4c, d) ଦ୍ୱାରା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |
MSFragger ଦ୍ୱାରା ଚାଳିତ FragPipe କମ୍ପ୍ୟୁଟିଂ ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ବ୍ୟବହାର କରି ଅବଶିଷ୍ଟ ଚୟନକର୍ତ୍ତା ଅଧ୍ୟୟନ ପାଇଁ ଏକ ନିରପେକ୍ଷ କାର୍ଯ୍ୟ ପ୍ରବାହ |ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ ରଜନୀରୁ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ସର ଫଟୋଗ୍ରାଫ୍ ଅନୁମତି ଦେବା ପାଇଁ କ୍ଲିକ୍ ରସାୟନରେ କ୍ଲିଭେବଲ୍ ଲିଙ୍କର୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ |ଅନେକ ପରିବର୍ତ୍ତନ, ତଥା ପ୍ରଯୁଜ୍ୟ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶ ଚିହ୍ନଟ କରିବାକୁ ଏକ ଖୋଲା ସନ୍ଧାନ ଆରମ୍ଭ କରାଯାଇଥିଲା |b ସମଗ୍ର ପ୍ରୋଟିମ୍ରେ ଘଟୁଥିବା ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକର ଭରଣା ନ୍ୟସ୍ତ କରନ୍ତୁ |ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ମ୍ୟାପିଙ୍ଗ୍ PSM |ପ୍ରୋବ 3 ସହିତ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ସାଇଟଗୁଡିକର MS2 ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରାଲ୍ ଟିପ୍ପଣୀd PDPL ମାର୍କରଗୁଡିକ ପରୀକ୍ଷା କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ମ୍ୟୁଟେସନ୍ ଆସେ |ଫ୍ଲାଗ୍ ଆଣ୍ଟି ଚିହ୍ନଟ ପାଇଁ PRDX3 (H155A, H225A) ଏବଂ PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ ହୋଇଥିଲା |ଇ ସିନ୍ଥେଟିକ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ପ୍ରୋବ 3 ର ଉପସ୍ଥିତିରେ ଶୁଦ୍ଧ ମିନିସୋଗ ସହିତ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ LC-MS ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମରେ Δm +247 ଏବଂ +229 ସହିତ ସମ୍ପୃକ୍ତ ଉତ୍ପାଦଗୁଡିକ ଉଲ୍ଲେଖ କରାଯାଇଥିଲା |f ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ ପ୍ରୋଟିନ୍-ଟୁ-ପ୍ରୋଟିନ୍ ଇଣ୍ଟରାକେସନ୍ ମିନିସୋଗ୍ -6 x ହିସ୍-ଟ୍ୟାଗ୍ ଏବଂ ଆଣ୍ଟି -6 x ହିସ୍ ଆଣ୍ଟିବାଡି ସହିତ ମଡେଲ୍ |ଆଲୋକର ସଂସ୍ପର୍ଶରେ ଆସିବା ସମୟ ଉପରେ ନିର୍ଭର କରି ଆଣ୍ଟିବାୟୋଟିନ୍ (ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ-ଏଚଆରପି) ଏବଂ ମିନି-ସୋଗ -6x ହିସ୍ / ଆଣ୍ଟି -6 x ତାଙ୍କ ଆଣ୍ଟିବଡି କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସର ଆଣ୍ଟି-ମାଉସ୍ ୱେଷ୍ଟର୍ଣ୍ଣ ବ୍ଲଟ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ |ବ୍ୟକ୍ତିଗତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାଇଁ ଲେବଲ୍ ସଂପୃକ୍ତ ମଲିକୁଲାର୍ ଓଜନରେ ପ୍ରକାଶ କରାଯାଇଥାଏ: LC ଆଣ୍ଟିବଡି ଲାଇଟ୍ ଚେନ୍, HC ଆଣ୍ଟିବଡି ଭାରୀ ଚେନ୍ |ଏହି ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ ସମାନ ଫଳାଫଳ ସହିତ ଅତିକମରେ ଦୁଇଥର ପୁନରାବୃତ୍ତି କରାଯାଇଥିଲା |
ଲେବେଲିଂ ସାଇଟର ବାୟୋକେମିକାଲ୍ ଯାଞ୍ଚ ପାଇଁ, PRDX3 ଏବଂ PRDX1 ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି ଦ୍ identified ାରା ଚିହ୍ନିତ ହୋଇ ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ରୁ ଆଲାନାଇନ୍ କୁ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଟ୍ରାନ୍ସଫେକ୍ସନ୍ ଆସେସରେ ବନ୍ୟ ପ୍ରକାର ସହିତ ତୁଳନା କରାଯାଇଥିଲା |PDPL ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ଦର୍ଶାଇଲା ଯେ ପରିବର୍ତ୍ତନଟି ଲେବେଲିଂକୁ ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ କରିଛି (ଚିତ୍ର 2d) |ଏହି ସମୟରେ, ଖୋଲା ସନ୍ଧାନରେ ଚିହ୍ନିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ କ୍ରମଗୁଡିକ ସିନ୍ଥାଇଜ୍ ହୋଇ ଭିଟ୍ରୋରେ ବିଶୋଧିତ ମିନିସୋଗ୍ ସହିତ ପ୍ରୋବ 3 ଏବଂ ନୀଳ ଆଲୋକର ଉପସ୍ଥିତିରେ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା କରାଯାଇଥିଲା, LC-MS ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ ହେଲେ +247 ଏବଂ +229 Da ର ବହୁଳ ଶିଫ୍ଟ ସହିତ ଉତ୍ପାଦ ଉତ୍ପାଦନ କଲା | । 2e))ମିନିସୋଗ୍ ଫଟୋ ଆକ୍ଟିଭେସନ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ପ୍ରକ୍ସିମାଲ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଇଣ୍ଟରାକ୍ଟିଙ୍ଗ୍ ଭିଟ୍ରୋରେ ଲେବଲ୍ ହୋଇପାରିବ କି ନାହିଁ ପରୀକ୍ଷା କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ ମିନିସୋଗ୍ -6x ହିସ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏବଂ ଭିଟ୍ରୋରେ ତାଙ୍କ ଆଣ୍ଟି-ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟିବଡି (ଚିତ୍ର 2f) ମଧ୍ୟରେ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଦ୍ୱାରା ଏକ କୃତ୍ରିମ ନିକଟତର ଅନୁଧ୍ୟାନ ଡିଜାଇନ୍ କରିଛୁ |ଏହି ଅନୁଧ୍ୟାନରେ, ଆମେ ମିନିସୋଗ୍ ସହିତ ଆଣ୍ଟିବଡି ଭାରୀ ଏବଂ ହାଲୁକା ଶୃଙ୍ଖଳାର ପ୍ରକ୍ସିମାଲ୍ ଲେବଲ୍ ଆଶା କରିଥିଲୁ |ବାସ୍ତବରେ, ଆଣ୍ଟି-ମାଉସ୍ (ଆଣ୍ଟି -6 x ହିସ୍-ଲେବଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡିର ଭାରୀ ଏବଂ ହାଲୁକା ଶୃଙ୍ଖଳାକୁ ଚିହ୍ନିବା) ଏବଂ ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ ପାଶ୍ଚାତ୍ୟ ବ୍ଲଟ୍ ଭାରୀ ଏବଂ ହାଲୁକା ଶୃଙ୍ଖଳାର ଦୃ bi ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ୍ ଦେଖାଇଲା |ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ, 6xHis ଟ୍ୟାଗ୍ ଏବଂ ହାଲୁକା ଏବଂ ଭାରୀ ଚେନ୍ ମଧ୍ୟରେ କ୍ରସ୍-ଲିଙ୍କ୍ ହେତୁ ଆମେ ମିନିସୋଗ୍ ଅଟୋବିଓଟିନାଇଲେସନ୍ ଲକ୍ଷ୍ୟ କରିଥିଲୁ, ଯାହା ଲାଇସେନ୍ ଏବଂ 2-ଅକ୍ସୋ-ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ପ୍ରକ୍ସିମାଲ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମଧ୍ୟରେ ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ବ୍ୟବଧାନ ସହିତ ଜଡିତ ହୋଇପାରେ |ପରିଶେଷରେ, ଆମେ ସିଦ୍ଧାନ୍ତ ନେଉଛୁ ଯେ PDPL ଏକ ନିର୍ଭରଶୀଳ manner ଙ୍ଗରେ ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରେ |
ଆମର ପରବର୍ତ୍ତୀ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଥିଲା ସେଟୁ ଲେବେଲିଂର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ ସବସେଲୁଲାର୍ ପ୍ରୋଟିମ୍କୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବା |ତେଣୁ, ଆମେ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍, ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ମ୍ୟାଟ୍ରିକ୍ସ, କିମ୍ବା HEK293T କୋଷଗୁଡ଼ିକର ବାହ୍ୟ ER ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ (ଚିତ୍ର 3a) ରେ ସ୍ଥିର କରିଥିଲୁ |ଜେଲ୍ ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ବିଶ୍ଳେଷଣରେ ତିନୋଟି ସବସେଲୁଲାର୍ ସ୍ଥାନରେ ପ୍ରଚୁର ଲେବଲ୍ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଏବଂ ବିଭିନ୍ନ ଲେବେଲିଂ s ାଞ୍ଚା (ଚିତ୍ର 3 ବି) ପ୍ରକାଶ ପାଇଲା |ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ଇମେଜିଙ୍ଗ ବିଶ୍ଳେଷଣ PDPL ର ଉଚ୍ଚ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଦେଖାଇଲା (ଚିତ୍ର 3c) |ଫ୍ଲୋରୋସେନ୍ସ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ବ୍ୟବହାର କରି ସବସେଲୁଲାର ପ୍ରୋଟୋମକୁ ପୃଥକ କରିବା ପାଇଁ ରୋଡାମାଇନ୍ ରଙ୍ଗ ସହିତ କ୍ଲିକ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ଦ୍ PD ାରା PDPL କାର୍ଯ୍ୟ ପ୍ରବାହ ଅନୁସରଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ PDPL ସଙ୍କେତଗୁଡିକ DAPI, ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଟ୍ରାକର୍, କିମ୍ବା ER ଟ୍ରାକର୍ ସହିତ କୋଲୋକାଲାଇଜ୍ ହୋଇ PDPL ର ଉଚ୍ଚ ବିଶ୍ୱସ୍ତତାକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରିଥିଲା ​​|ତିନୋଟି ଅର୍ଗାନେଲ୍ ଅବସ୍ଥାନ ପାଇଁ, ଆଭିଡିନ ପାଶ୍ଚାତ୍ୟ ବ୍ଲଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରି TurboID ସହିତ PDPL ର ପାର୍ଶ୍ compar ତୁଳନାତ୍ମକତା ଦେଖାଇଲା ଯେ PDPL କୁ ନିଜ ନିଜ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ତୁଳନାରେ ଅଧିକ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଭାବରେ ଲେବଲ୍ କରାଯାଇଛି |PDPL ପରିସ୍ଥିତିରେ, ଅଧିକ PDPL- ଲେବଲ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 6a-d) ସୂଚାଇ ଅଧିକ ଲେବଲ୍ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଦେଖାଗଲା |
miniSOG- ମଧ୍ୟସ୍ଥ ଅର୍ଗାନେଲ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରୋଟୋମ ଲେବେଲିଂର ଏକ ସ୍କିମେଟିକ୍ ଉପସ୍ଥାପନା |ମିନିସୋଗ୍ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ମ୍ୟାଟ୍ରିକ୍ସକୁ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ମାଧ୍ୟମରେ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ 23 ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ମାନବ COX4 (ମାଇଟୋ-ମିନିସୋଗ୍), ଫ୍ୟୁଜନ୍ ମାଧ୍ୟମରେ H2B (ନ୍ୟୁକ୍ଲିଅସ୍-ମିନିସୋଗ୍) ଏବଂ ସେକ୍ 61β ER ମେମ୍ବ୍ରାନ୍ର ସାଇଟୋପ୍ଲାଜାମିକ୍ ପାର୍ଶ୍ୱ (ER-miniSOG) କୁ ଟାର୍ଗେଟ୍ କରେ | )ସୂଚକଗୁଡ଼ିକରେ ଜେଲ୍ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍, କନଫୋକାଲ୍ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ ଏବଂ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ |b ତିନୋଟି ଅର୍ଗାନେଲ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ PDPL ପ୍ରୋଫାଇଲର ପ୍ରତିନିଧୀ ଜେଲ୍ ପ୍ରତିଛବି |CBB କୁମାସି ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ ନୀଳ |c HEK293T କୋଷଗୁଡ଼ିକର ପ୍ରତିନିଧୀ କନଫୋକାଲ୍ ଚିତ୍ରଗୁଡ଼ିକ V5 (ଲାଲ୍) ନାମକ ଆଣ୍ଟିବଡି ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ବିଭିନ୍ନ ସବସେଲୁଲାର୍ ଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ ସହିତ ମିନିଏସୋଗିକୁ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ପ୍ରକାଶ କରିଥାଏ |ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆ ଏବଂ ER (ସବୁଜ) ପାଇଁ ସବସେଲୁଲାର୍ ମାର୍କର୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ |PDPL ୱାର୍କଫ୍ଲୋରେ Cy3-azide କ୍ଲିକ୍ ରସାୟନ ବ୍ୟବହାର କରି ମିନିସୋଗ୍ (ହଳଦିଆ) ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ସବସେଲୁଲାର୍ ପ୍ରୋଟିମ୍ ଚିହ୍ନଟ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ |ମାପ ଦଣ୍ଡ: 10 µ ମି।d ବିଭିନ୍ନ ଅର୍ଗାନେଲରେ PDPL- ଟ୍ୟାଗଡ୍ ପ୍ରୋଟୋମର ଆଗ୍ନେୟଗିରି ପ୍ଲଟ୍, ଅଣ-ଚିହ୍ନିତ ପରିମାଣ (n = 3 ସ୍ independent ାଧୀନ ଜ bi ବିକ ପରୀକ୍ଷଣ) ଦ୍ୱାରା ପରିମାଣିତ |ଆଗ୍ନେୟଗିରି ପ୍ଲଟରେ ଦୁଇ ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ଟେଷ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |ଏକ ନକାରାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ HEK293T ବନ୍ୟ ପ୍ରକାର ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା | ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ଲାଲ୍ ରଙ୍ଗରେ ହାଇଲାଇଟ୍ ହୋଇଛି (p <0.05 ଏବଂ> 2 ଗୁଣା ଆୟନ ତୀବ୍ରତା ପାର୍ଥକ୍ୟ) | ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ଲାଲ୍ ରଙ୍ଗରେ ହାଇଲାଇଟ୍ ହୋଇଛି (p <0.05 ଏବଂ> 2 ଗୁଣା ଆୟନ ତୀବ୍ରତା ପାର୍ଥକ୍ୟ) | Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в интеншности ионов)। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ଲାଲ୍ ରଙ୍ଗରେ ହାଇଲାଇଟ୍ ହୋଇଛି (p <0.05 ଏବଂ> ଆୟନର ତୀବ୍ରତାରେ 2 ଗୁଣ ପାର୍ଥକ୍ୟ) |<着 变化 的 <<<p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 差异。。<着 变化 变化 <<<p <0.05 和> 2 | Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в ионной силе)। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ଲାଲ୍ ରଙ୍ଗରେ ହାଇଲାଇଟ୍ ହୋଇଛି (p <0.05 ଏବଂ> ଆୟନିକ୍ ଶକ୍ତିରେ 2 ଗୁଣ ପାର୍ଥକ୍ୟ) |HEK293T-miniSOG ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରୋଟିନ୍ କିନ୍ତୁ HEK293T ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ ସବୁଜ ରଙ୍ଗରେ ଦେଖାଯାଏ |e ପରୀକ୍ଷଣରୁ ପ୍ରୋଟୋମିକ୍ ଡାଟାସେଟର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତାର ବିଶ୍ଳେଷଣ d।ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅର୍ଗାନେଲରେ ସମୁଦାୟ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରୋଟିନ୍ (ଲାଲ୍ ଏବଂ ସବୁଜ ବିନ୍ଦୁ) ଉପରେ ଚିହ୍ନିତ |ହିଷ୍ଟୋଗ୍ରାମ୍ ମାଇଟୋକାର୍ଟା .0.୦, ଗୋ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ଏ ଟିଙ୍ଗ୍ ଇତ୍ୟାଦି ଉପରେ ଆଧାର କରି ଅର୍ଗାନେଲରେ ସ୍ଥାନିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଦେଖାଏ |ଲୋକମାନେମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆ, ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟ ଏବଂ ER ପାଇଁ ପୃଥକ ଡାଟାବେସ୍ |ଏହି ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ ସମାନ ଫଳାଫଳ ସହିତ ଅତିକମରେ ଦୁଇଥର ପୁନରାବୃତ୍ତି କରାଯାଇଥିଲା |କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ଫାଇଲ ଆକାରରେ କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଛି |
ଜେଲ୍ ଏବଂ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ ଫଳାଫଳ ଦ୍ୱାରା ଉତ୍ସାହିତ, ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅର୍ଗାନେଲରେ ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରୋଟୋମକୁ ପରିମାଣ କରିବା ପାଇଁ ଲେବଲ୍ ମୁକ୍ତ ପରିମାଣ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡାଟା 2) |ଅଣସଂରକ୍ଷିତ HEK293T ପୃଷ୍ଠଭୂମି ମାର୍କରଗୁଡିକ ବାହାର କରିବା ପାଇଁ ଏକ ନକାରାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା | ଆଗ୍ନେୟଗିରି ପ୍ଲଟ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣରେ ବହୁ ପରିମାଣରେ ସମୃଦ୍ଧ ପ୍ରୋଟିନ୍ (p <0.05 ଏବଂ> 2 ଗୁଣା ଆୟନର ତୀବ୍ରତା) ଏବଂ ସିଙ୍ଗଲେଟନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଥିଲା ଯାହା କେବଳ ମିନିସୋଗ୍-ଏକ୍ସପ୍ରେସନ୍ ଲାଇନ୍ (ଚିତ୍ର 3d ଲାଲ୍ ଏବଂ ସବୁଜ ବିନ୍ଦୁ) ରେ ଉପସ୍ଥିତ | ଆଗ୍ନେୟଗିରି ପ୍ଲଟ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣରେ ବହୁ ପରିମାଣରେ ସମୃଦ୍ଧ ପ୍ରୋଟିନ୍ (p <0.05 ଏବଂ> 2 ଗୁଣା ଆୟନର ତୀବ୍ରତା) ଏବଂ ସିଙ୍ଗଲେଟନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଥିଲା ଯାହା କେବଳ ମିନିସୋଗ୍-ଏକ୍ସପ୍ରେସନ୍ ଲାଇନ୍ (ଚିତ୍ର 3d ଲାଲ୍ ଏବଂ ସବୁଜ ବିନ୍ଦୁ) ରେ ଉପସ୍ଥିତ | Аназа чикака вулкана показал значительно обогщенные белки (p <0, 05 и> 2-кратная инт интингность ионов), а также одиночные белки, кот че присутствуют только в чияхх, рисы। ଆଗ୍ନେୟଗିରି ପ୍ଲଟ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣରେ ଯଥେଷ୍ଟ ସମୃଦ୍ଧ ପ୍ରୋଟିନ୍ (p <0.05 ଏବଂ> 2 ଗୁଣା ଆୟନର ତୀବ୍ରତା) ଏବଂ ଏକକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଦେଖାଗଲା ଯାହା କେବଳ ମିନିସୋଗ୍-ଏକ୍ସପ୍ରେସନ୍ ଲାଇନ୍ (ଚିତ୍ର 3d, ନାଲି ଏବଂ ସବୁଜ ବିନ୍ଦୁ) ରେ ଉପସ୍ଥିତ |S 火山 图 在于 <<p <0.05 和> 2 倍 离子 在于 在于 在于 在于 S S S S S S S S S S S S S S S S S S SMin is 分析 在于 <<p <0.05 和> 2 倍 离子 在于 在于 在于 minisog 表达 系 d d d d 3d 红色 绿色 图 Анжа чарика вулкана вявил значительно обогщенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в кресрес чинной чирии miniSOG (красные и зеленые точки на)। ଆଗ୍ନେୟଗିରି ପ୍ଲଟ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣରେ ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ସମୃଦ୍ଧ ପ୍ରୋଟିନ୍ (p <0.05 ଏବଂ> 2x ଆୟନିକ୍ ଶକ୍ତି) ଏବଂ କେବଳ ମିନିସୋଗ୍ ଏକ୍ସପ୍ରେସନ୍ ଲାଇନ୍ରେ ଥିବା ଏକକ ପ୍ରୋଟିନ୍ (ଚିତ୍ର 3d ରେ ଲାଲ ଏବଂ ସବୁଜ ବିନ୍ଦୁ) ପ୍ରକାଶ ପାଇଲା |ଏହି ତଥ୍ୟଗୁଡିକୁ ମିଶାଇ ଆମେ ଯଥାକ୍ରମେ 1364, 461, ଏବଂ 911 ପରିସଂଖ୍ୟାନିକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଆଣବିକ, ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଏବଂ ER ବାହ୍ୟ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିଛୁ |ଅର୍ଗାନେଲ-ଲୋକାଲାଇଜଡ୍ PDPL ର ସଠିକତା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବାକୁ, ଆମେ ମାଇଟୋକାର୍ଟା .0.୦, ଜିନ୍ ଅନ୍ଟୋଲୋଜି (GO) ବିଶ୍ଳେଷଣ ଏବଂ ଏ ଟିଙ୍ଗ୍ ଇତ୍ୟାଦି ବ୍ୟବହାର କରିଥିଲୁ |ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆ, ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍, ଏବଂ ER ପାଇଁ 73.4, 78.5, ଏବଂ 73.0% (ଚିତ୍ର 3e) ର ସଠିକତା ଅନୁଯାୟୀ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଥିବା ପ୍ରୋଟିନଗୁଡିକର ଅର୍ଗାନେଲ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ପରୀକ୍ଷା କରିବାକୁ ଏକ ଡାଟା ସେଟ୍ 8 ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |PDPL ର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ନିଶ୍ଚିତ କରେ ଯେ PDPL ଅର୍ଗାନେଲ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପ୍ରୋଟୋମଗୁଡ଼ିକୁ ଚିହ୍ନିବା ପାଇଁ ଏକ ଆଦର୍ଶ ଉପକରଣ |ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ, ଚିହ୍ନିତ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ପ୍ରୋଟିନଗୁଡିକର ସବମୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ଫାଶରେ ପଡିଥିବା ପ୍ରୋଟିମ୍ ମୁଖ୍ୟତ the ମ୍ୟାଟ୍ରିକ୍ସ ଏବଂ ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଇଥିଲା (ଯଥାକ୍ରମେ 226 ଏବଂ 106), ଯାହା ମୋଟ ଚିହ୍ନିତ ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ଗୁଡିକର 91.7% (362) ଅଟେ |ଏକ ଉଚ୍ଚ ସ୍ତରର PDPL ଅତିରିକ୍ତ ଭାବରେ ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 7a) |ସେହିଭଳି, ସବନ୍ୟୁକ୍ଲିୟର ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ଧରାଯାଇଥିବା ପ୍ରୋଟିମ୍ ମୁଖ୍ୟତ the ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସ୍, ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓପ୍ଲାଜମ୍ ଏବଂ ନ୍ୟୁକ୍ଲିଅଲସ୍ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 7b) ରେ ବଣ୍ଟନ କରାଯାଇଥିଲା |ଆଣବିକ ଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ ସିଗନାଲ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ (3xNLS) ସହିତ ଆଣବିକ ପ୍ରୋଟୋମିକ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ H2B ନିର୍ମାଣ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 7c - h) ସହିତ ସମାନ ସଠିକତା ଦେଖାଇଲା |PDPL ମାର୍କର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାକୁ, ଆଣବିକ ଲାମିନିନ A କୁ ଅଧିକ ଚତୁରତାର ସହ ସ୍ଥାନୀୟ POI7 ଜାଲ ଭାବରେ ଚୟନ କରାଯାଇଥିଲା |PDPL 36 ଟି ଯଥେଷ୍ଟ ସମୃଦ୍ଧ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିଛି, ସେଥିମଧ୍ୟରୁ 12 ଟି ପ୍ରୋଟିନ୍ (ଲାମିନ୍ ଏ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରି 30.0%) ଭଲ-ବର୍ଣ୍ଣିତ ଲାମିନ୍ A ଇଣ୍ଟରାକ୍ଟିଙ୍ଗ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍, ଷ୍ଟ୍ରିଙ୍ଗ ଡାଟାବେସ୍ ଦ୍ୱାରା ଟିପ୍ପଣୀ ହୋଇଛି, BioID ପଦ୍ଧତି (122 ପ୍ରୋଟିନ୍) 28 ଠାରୁ 28., 22.9 %) 7. ଆମର ପଦ୍ଧତି କମ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିଥିଲା, ସମ୍ଭବତ limited ସୀମିତ ଲେବେଲିଂ କ୍ଷେତ୍ର ହେତୁ, ଯାହା ଅଧିକ ସକ୍ରିୟ ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ଦ୍ୱାରା ସମ୍ଭବ ହୋଇଥିଲା |GO ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ମୁଖ୍ୟତ the ନ୍ୟୁକ୍ଲିଓପ୍ଲାଜ୍ (26), ଆଣବିକ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ (10), ଆଣବିକ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ (9) ଏବଂ ଆଣବିକ ପୋରସ୍ (5) ରେ ଅବସ୍ଥିତ |ସାମୂହିକ ଭାବରେ, ଏହି ପରମାଣୁ-ଲୋକାଲ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସମୃଦ୍ଧ ପ୍ରୋଟିନଗୁଡିକର 80% ଅଂଶ ଗ୍ରହଣ କରିଥିଲା, ଯାହାକି PDPL (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡ଼ିଗ। 8a - d) ର ବିଶେଷତାକୁ ଦର୍ଶାଏ |
ଅର୍ଗାନେଲରେ ନିକଟତର ମାର୍କିଂ କରିବା ପାଇଁ PDPL ର କ୍ଷମତା ପ୍ରତିଷ୍ଠା କରି, ତା’ପରେ ଆମେ ପରୀକ୍ଷଣ କରିଥିଲୁ ଯେ POI ବାନ୍ଧୁଥିବା ଅଂଶୀଦାରମାନଙ୍କୁ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରିବା ପାଇଁ PDPL ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇପାରିବ କି ନାହିଁ |ବିଶେଷ ଭାବରେ, ଆମେ ସାଇଟୋସୋଲିକ୍ ପ୍ରୋଟିନର PDPL ବିଶ୍ଳେଷଣକୁ ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରିବାକୁ ଚେଷ୍ଟା କରିଥିଲୁ, ଯାହା ସେମାନଙ୍କର ଗତିଶୀଳ ପ୍ରକୃତି ହେତୁ ସେମାନଙ୍କର ମେମ୍ବ୍ରେନ୍-ଲୋକାଲାଇଜ୍ ପ୍ରତିପକ୍ଷ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ କଷ୍ଟସାଧ୍ୟ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଭାବରେ ବିବେଚନା କରାଯାଏ |ବ୍ରୋମୋଡୋମେନ୍ ଏବଂ ଏକ୍ସଟ୍ରାଟର୍ମିନାଲ୍ (BET) ପ୍ରୋଟିନ୍ BRD4 ବିଭିନ୍ନ ରୋଗରେ ଏହାର ପ୍ରମୁଖ ଭୂମିକା ପାଇଁ ଆମ ଦୃଷ୍ଟି ଆକର୍ଷଣ କରିଛି 35, 36 |BRD4 ଦ୍ formed ାରା ଗଠିତ ଜଟିଳ ହେଉଛି ଏକ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନାଲ କୋଆକ୍ଟିଭେଟର ଏବଂ ଏକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଚିକିତ୍ସା ଲକ୍ଷ୍ୟ |C-myc ଏବଂ Wnt5a ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ଫ୍ୟାକ୍ଟରଗୁଡିକର ଅଭିବ୍ୟକ୍ତିକୁ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରି, BRD4 ତୀବ୍ର ମାଇଲୋଏଡ୍ ଲ୍ୟୁକେମିଆ (AML), ଏକାଧିକ ମାଇଲୋମା, ବୁର୍କିଟ୍ ଲିମ୍ଫୋମା, କୋଲୋନ୍ କର୍କଟ ଏବଂ ପ୍ରଦାହଜନକ ରୋଗର ଏକ ପ୍ରମୁଖ ନିର୍ଣ୍ଣୟକାରୀ ବୋଲି ବିବେଚନା କରାଯାଏ |ଏଥିସହ, କେତେକ ଜୀବାଣୁ BRD4 କୁ ଭାଇରାଲ୍ ଏବଂ ସେଲୁଲାର୍ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିବା ପାଇଁ ଟାର୍ଗେଟ୍ କରନ୍ତି, ଯେପରିକି ପପିଲୋମାଭାଇରସ୍, ଏଚ୍.ଆଇ.ଭି ଏବଂ SARS-CoV-236,39 |
PDPL ବ୍ୟବହାର କରି BRD4 ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ମାନଚିତ୍ର କରିବା ପାଇଁ, ଆମେ BRS4 ର ଏକ କ୍ଷୁଦ୍ର N- କିମ୍ବା C- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଆଇସୋଫର୍ମ ସହିତ miniSOG କୁ ମିଶ୍ରିତ କଲୁ |ପ୍ରୋଟୋମିକ୍ ଫଳାଫଳ ଦୁଇଟି ନିର୍ମାଣ ମଧ୍ୟରେ ଏକ ଉଚ୍ଚ ସ୍ତରର ଓଭରଲପ୍ ପ୍ରକାଶ କଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 9a) |MiniSOG-H2B ସହିତ ଚିହ୍ନିତ ଆଣବିକ ପ୍ରୋଟିମ୍ BRD4 (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 9b) ସହିତ କଥାବାର୍ତ୍ତା କରୁଥିବା 77.6% ପ୍ରୋଟିନ୍ ଧାରଣ କରିଥାଏ |ତାପରେ, ମାର୍କର ବ୍ୟାଡ୍ୟୁସ୍ (ଚିତ୍ର 4a ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡାଟା 3) କୁ ସଜାଡିବା ପାଇଁ ବିଭିନ୍ନ ସମୟର ଆଲୋକୀକରଣ (2, 5, 10, 20 ମିନିଟ୍) ବ୍ୟବହୃତ ହେଲା |ଆମେ ସିଦ୍ଧାନ୍ତ ନେଉଛୁ ଯେ କ୍ଷୁଦ୍ର ଫଟୋଗ୍ରାଫିରେ, PDPL ମୁଖ୍ୟତ direct ପ୍ରତ୍ୟକ୍ଷ ବନ୍ଧନ ଭାଗୀଦାରୀକୁ ଲେବଲ୍ କରିବ, ଯେତେବେଳେ ଅଧିକ ସମୟ କ୍ଷୁଦ୍ର ଫଟୋ ଆକ୍ଟିଭେସନ୍ ପିରିୟଡରେ ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରିବ ଏବଂ ଲେବେଲିଂ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସରେ ପରୋକ୍ଷ ଲକ୍ଷ୍ୟ ମଧ୍ୟ ରହିବ |ବାସ୍ତବରେ, ଆମେ ପାଖାପାଖି ସମୟ ପଏଣ୍ଟଗୁଡିକ ମଧ୍ୟରେ ଦୃ strong ଼ ଓଭରଲପ୍ ପାଇଲୁ (2 ଏବଂ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 84.6%; 5 ଏବଂ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 87.7%; 10 ଏବଂ 20 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 98.7%) (ଚିତ୍ର 4 ବି ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 9c) |ସମସ୍ତ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଗୋଷ୍ଠୀରେ, ଆମେ କେବଳ BRD4 ସେଲ୍ଫ ଲେବେଲିଂ ନୁହେଁ, କିନ୍ତୁ ଷ୍ଟ୍ରିଙ୍ଗ ଡାଟାବେସରେ ଟିପ୍ପଣୀ ହୋଇଥିବା MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, ଏବଂ HMGB1 ଭଳି ଅନେକ ଜଣାଶୁଣା ଲକ୍ଷ୍ୟ ପାଇଲୁ |ଏହି ଲକ୍ଷ୍ୟଗୁଡିକର ଆୟନିକ୍ ଶକ୍ତି ଏକ୍ସପୋଜର ସମୟ ସହିତ ଆନୁପାତିକ (ଚିତ୍ର 4c ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 9d) |2 ମିନିଟର ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରୋଟିନଗୁଡିକର GO ବିଶ୍ଳେଷଣରୁ ଜଣାପଡିଛି ଯେ ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସରେ ସ୍ଥାନିତ ହୋଇଥିଲେ ଏବଂ କ୍ରୋମାଟିନ୍ ରିମୋଡେଲିଂ ଏବଂ RNA ପଲିମେରେଜ୍ କାର୍ଯ୍ୟରେ ଜଡିତ ଥିଲେ |ପ୍ରୋଟିନର ମଲିକୁଲାର କାର୍ଯ୍ୟ କ୍ରୋମାଟିନ୍ ବାଇଣ୍ଡିଂ କିମ୍ବା ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନାଲ କୋଆକ୍ଟିଭେସନ୍ରେ ସମୃଦ୍ଧ ହୋଇଥିଲା, BRD4 କାର୍ଯ୍ୟ (ଚିତ୍ର 4d) ସହିତ ସମାନ |ଷ୍ଟ୍ରିଙ୍ଗ୍ ଡାଟାବେସ୍-ସକ୍ଷମ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାରସ୍ପରିକ ବିଶ୍ଳେଷଣରେ BRD4 ଏବଂ HDAC ବାନ୍ଧୁଥିବା ଆସେଟିଲେଟେଡ୍ ହିଷ୍ଟୋନ୍ ସହିତ BRD4 ଏବଂ HDAC ପରିବାର ଇଣ୍ଟରାକ୍ଟିଙ୍ଗ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସଗୁଡିକ ମଧ୍ୟରେ SIN3A, NCOR2, BCOR, ଏବଂ SAP130 (ଚିତ୍ର 4e ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 9e) ମଧ୍ୟରେ ପ୍ରଥମ ସ୍ତରର ପରୋକ୍ଷ ପାରସ୍ପରିକ ସମ୍ପର୍କ ପ୍ରକାଶ ପାଇଲା | ।।ଏଥିସହ, Sin3A, NSUN2, Fus, ଏବଂ SFPQ ସହିତ LC-MS / MS ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରତିନିଧୀ ଲକ୍ଷ୍ୟଗୁଡିକ ପାଶ୍ଚାତ୍ୟ ବ୍ଲୋଟିଂ (ଚିତ୍ର 4f) ଦ୍ୱାରା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା |ସମ୍ପ୍ରତି, BRD4 ର କ୍ଷୁଦ୍ର ଆଇସୋଫର୍ମ ତରଳ-ତରଳ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପୃଥକତା (LLPS) ଗୁଣ ସହିତ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟ ସୃଷ୍ଟି କରୁଥିବା ଜଣାଯାଇଛି |RNA ବାନ୍ଧୁଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ Fus ଏବଂ SFPQ ବିଭିନ୍ନ ସେଲୁଲାର୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାର LLPS ମଧ୍ୟସ୍ଥତା କରେ ଏବଂ ଏଠାରେ ଅଣସଂରକ୍ଷିତ BRD4 ବାଇଣ୍ଡ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଛି |BRD4 ଏବଂ SFPQ ମଧ୍ୟରେ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା ଇମ୍ୟୁନୋପ୍ରେସିପିଟେସନ୍ (କୋ-ଆଇପି) ପରୀକ୍ଷଣ (ଚିତ୍ର 4g) ଦ୍ୱାରା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହାକି BRD4- ମଧ୍ୟସ୍ଥ ତରଳ-ତରଳ ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକ ପୃଥକଏକାଠି ନିଆଗଲା, ଏହି ଫଳାଫଳଗୁଡିକ ସୂଚିତ କରେ ଯେ ଜଣାଶୁଣା BRD4 ପାରସ୍ପରିକ ତଥା ଅଜ୍ଞାତ ବନ୍ଧନ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ PDPL ଏକ ଆଦର୍ଶ ପ୍ଲାଟଫର୍ମ |
miniSOG- ମଧ୍ୟସ୍ଥ BRD4 ନିକଟତର ମାର୍କିଂର ଏକ ସ୍କିଜେଟିକ୍ ଉପସ୍ଥାପନା, ଏକ୍ସପୋଜର ସମୟ: 2, 5, 10, ଏବଂ 20 ମିନିଟ୍ |b ବିଭିନ୍ନ ଆଲୋକିତ ସମୟରେ ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରୋଟିନଗୁଡ଼ିକର ଆଚ୍ଛାଦନ |HEK293T-miniSOG-BRD4 ରେ ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସମୃଦ୍ଧତା ବନ୍ୟ ପ୍ରକାର HEK293T ତୁଳନାରେ ପରିସଂଖ୍ୟାନିକ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ଥିଲା |c ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଏକ୍ସପୋଜର ସମୟ ମଧ୍ୟରେ BRD4- ବାନ୍ଧୁଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ଜଣାଶୁଣା ଅଣ-ପ୍ରତିନିଧୀ ପ୍ରତିନିଧୀ ପରିମାଣ କରିବାବେଳେ ଆଇନ୍ ତୀବ୍ରତା |n = 3 ଜ olog ବଗତ ଭାବରେ ସ୍ independent ାଧୀନ ନମୁନା |ଡାଟା ହାରାହାରି ± ମାନକ ବିଘ୍ନ ଭାବରେ ଉପସ୍ଥାପିତ ହୁଏ |d 2 ମିନିଟର ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରୋଟିନଗୁଡିକର ଜିନ୍ ଅନଟୋଲୋଜିକାଲ୍ ଆନାଲିସିସ୍ (GO) |ପ୍ରଥମ ଦଶଟି GO ସର୍ତ୍ତାବଳୀ ତାଲିକାଭୁକ୍ତ |GO ଟର୍ମ ବର୍ଗ ଅନୁଯାୟୀ ବବୁଲଗୁଡିକ ରଙ୍ଗିନ ହୋଇଥାଏ ଏବଂ ପ୍ରତ୍ୟେକ ଶବ୍ଦରେ ମିଳୁଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଂଖ୍ୟା ସହିତ ବବୁଲ୍ ଆକାର ଆନୁପାତିକ |e BRD4 ସହିତ ପାରସ୍ପରିକ କ୍ରିୟା କରୁଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକର ଷ୍ଟ୍ରିଙ୍ଗ୍ ଆନାଲିସିସ୍ |ହଳଦିଆ ବୃତ୍ତଗୁଡ଼ିକ ହେଉଛି ସିଧାସଳଖ ଆଲୁଅ ଏବଂ ଧୂସର ବୃତ୍ତଗୁଡ଼ିକ ହେଉଛି ପରୋକ୍ଷ ଆଲୁଅର ପ୍ରଥମ ସ୍ତର |ଲାଲ୍ ରେଖାଗୁଡ଼ିକ ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଭାବରେ ନିର୍ଣ୍ଣୟ ହୋଇଥିବା ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ପ୍ରତିପାଦିତ କରେ ଏବଂ ନୀଳ ରେଖାଗୁଡ଼ିକ ପୂର୍ବାନୁମାନ କରାଯାଇଥିବା ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ପ୍ରତିପାଦିତ କରେ |f LC-MS / MS ରେ ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରତିନିଧୀ BRD4 ବନ୍ଧନ ଲକ୍ଷ୍ୟଗୁଡିକ ପାଶ୍ଚାତ୍ୟ ବ୍ଲୋଟିଂ ଦ୍ୱାରା ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା |g ସହ-ପ୍ରତିରୋପଣ ପରୀକ୍ଷଣ SFPQ ଏବଂ BRD4 ମଧ୍ୟରେ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟକୁ ନିଶ୍ଚିତ କରେ |ଏହି ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ ସମାନ ଫଳାଫଳ ସହିତ ଅତିକମରେ ଦୁଇଥର ପୁନରାବୃତ୍ତି କରାଯାଇଥିଲା |କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ଫାଇଲ ଆକାରରେ କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଛି |
ପଞ୍ଜୀକୃତ ହୋଇନଥିବା POI- ସହ ଜଡିତ ଲକ୍ଷ୍ୟଗୁଡିକ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ସହିତ, ଆମେ ଅନୁମାନ କରୁଛୁ ଯେ PDPL ଏନଜାଇମ୍ ପାଇଁ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ ହେବ, ଯାହା ପଞ୍ଜୀକୃତ ହୋଇନଥିବା ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ଟିପ୍ପଣୀ କରିବା ପାଇଁ ବଡ଼ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସରେ ପରୋକ୍ଷ ବନ୍ଧନ ପ୍ରୋଟିନର ଚରିତ୍ରକରଣ ଆବଶ୍ୟକ କରିବ |ପାର୍କିନ୍ (PARK2 ଦ୍ enc ାରା ଏନକୋଡ୍) ହେଉଛି ଏକ E3 ଲିଗେଜ୍ ଏବଂ ପାର୍କିନ୍ରେ ପରିବର୍ତ୍ତନ, ଅଟୋସୋମାଲ୍ ରିସେସିଭ୍ ବାଳକ ପାର୍କିନ୍ସନ୍ ରୋଗ (AR-JP) 42 ସୃଷ୍ଟି କରୁଥିବା ଜଣାଶୁଣା |ଏଥିସହ, ପାର୍କିନ୍କୁ ମାଇଟୋଫାଗି (ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ଅଟୋଫାଗି) ଏବଂ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳ ଅମ୍ଳଜାନ ପ୍ରଜାତିର ଅପସାରଣ ପାଇଁ ଜରୁରୀ ବୋଲି ବର୍ଣ୍ଣନା କରାଯାଇଛି |ଅବଶ୍ୟ, ଯଦିଓ ଅନେକ ପାର୍କିନ୍ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଚିହ୍ନଟ ହୋଇଛି, ଏହି ରୋଗରେ ପାର୍କିନ୍ ର ଭୂମିକା ଅସ୍ପଷ୍ଟ ରହିଛି |ଏହାର ଅଣ-ବର୍ଣ୍ଣିତ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଗୁଡିକୁ ଟିପ୍ପଣୀ କରିବାକୁ, PDPL ପାର୍କିନ୍ ର N- କିମ୍ବା C- ଟର୍ମିନାସରେ ମିନିଏସୋଗ୍ ଯୋଗ କରି ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା |PINK1- ପାର୍କିନ୍ ପଥ ଦେଇ ପାର୍କିନ୍ ସକ୍ରିୟ କରିବା ପାଇଁ କାର୍ବନିଲ୍ ସିଆନାଇଡ୍ ପ୍ରୋଟନ୍ ପରିବହନକାରୀ ମି-କ୍ଲୋରୋଫେନିଲାଇଡ୍ରାଜୋନ୍ (CCCP) ସହିତ କୋଷଗୁଡିକ ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିଲା |ଆମର BRD4 PDPL ଫଳାଫଳ ତୁଳନାରେ, ପାର୍କିନ୍ ଏନ-ଟର୍ମିନାସ୍ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଟାର୍ଗେଟ୍ ପ୍ରୋଟିନର ଏକ ବୃହତ ସେଟ୍ ପ୍ରକାଶ କଲା, ଯଦିଓ ଏହା ସି-ଟର୍ମିନାସର ଏକ ବୃହତ ଅଂଶକୁ (210 ମଧ୍ୟରୁ 177) ଆଚ୍ଛାଦନ କରିଥିଲା ​​(ଚିତ୍ର 5a, b ଏବଂ ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଡାଟା 4) |ଫଳାଫଳ ରିପୋର୍ଟଗୁଡିକ ସହିତ ସମାନ ଅଟେ ଯେ N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଟ୍ୟାଗଗୁଡ଼ିକ ପାର୍କିନ୍ 44 କୁ ସକ୍ରିୟ କରିପାରେ |ଆଶ୍ଚର୍ଯ୍ୟର କଥା, ପାର୍କିନ୍ 43 ପାଇଁ ପ୍ରକାଶିତ AP-MS ଫଳାଫଳ ସହିତ ଆମ ତଥ୍ୟରେ କେବଳ 18 ଟି ଓଭରଲିପ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ରହିଥିଲା, ସମ୍ଭବତ cell ସେଲ୍ ଲାଇନ୍ ଏବଂ ପ୍ରୋଟୋମିକ୍ସ ୱାର୍କଫ୍ଲୋ ମଧ୍ୟରେ ପାର୍ଥକ୍ୟ ହେତୁ |ଦୁଇଟି ପଦ୍ଧତି (ଚିତ୍ର 5c) 43 ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନିତ ଚାରୋଟି ଜଣାଶୁଣା ପ୍ରୋଟିନ୍ (ARDM1, HSPA8, PSMD14, ଏବଂ PSMC3) ସହିତ |LC-MS / MS ର ଫଳାଫଳକୁ ଅଧିକ ବ valid ଧ କରିବାକୁ, PDPL ଚିକିତ୍ସା ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ପାଶ୍ଚାତ୍ୟ ବ୍ଲୋଟିଂ HEK293T ପ୍ୟାରେଣ୍ଟ୍ ସେଲ୍ ଆସେ ଏବଂ ସ୍ଥିର N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ପାର୍କିନ୍ ଲାଇନର ଫଳାଫଳ ତୁଳନା କରିବାକୁ ବ୍ୟବହୃତ ହେଲା |ପୂର୍ବରୁ ଅଜ୍ଞାତ ଲକ୍ଷ୍ୟ CDK2, DUT, CTBP1, ଏବଂ PSMC4 ଏକ ଜଣାଶୁଣା ବାଇଣ୍ଡର, DNAJB1 (ଚିତ୍ର 5d) ସହିତ ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା |
HEK293T କୋଷଗୁଡ଼ିକରେ ପାର୍କିନ୍-ଇଣ୍ଟରାକ୍ଟିଙ୍ଗ୍ ପ୍ରୋଟିନଗୁଡିକର ଆଗ୍ନେୟଗିରି ପ୍ଲଟ୍ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ପ୍ରକାଶିତ ମିନିସୋଗ୍ ସହିତ ପାର୍କିନ୍ ର N- କିମ୍ବା C- ଟର୍ମିନାସରେ ଫ୍ୟୁଜ୍ ହୋଇଛି (n = 3 ସ୍ independent ାଧୀନ ଜ bi ବିକ ପରୀକ୍ଷଣ) |ଆଗ୍ନେୟଗିରି ପ୍ଲଟରେ ଦୁଇ ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ଟେଷ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |HEK293T ଏକ ନକାରାତ୍ମକ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା | ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ଲାଲ୍ ରଙ୍ଗରେ ହାଇଲାଇଟ୍ ହୋଇଛି (p <0.05 ଏବଂ> 2 ଗୁଣା ଆୟନ ତୀବ୍ରତା ପାର୍ଥକ୍ୟ) | ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ଲାଲ୍ ରଙ୍ଗରେ ହାଇଲାଇଟ୍ ହୋଇଛି (p <0.05 ଏବଂ> 2 ଗୁଣା ଆୟନ ତୀବ୍ରତା ପାର୍ଥକ୍ୟ) | Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в интеншности ионов)। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ଲାଲ୍ ରଙ୍ଗରେ ହାଇଲାଇଟ୍ ହୋଇଛି (p <0.05 ଏବଂ> ଆୟନର ତୀବ୍ରତାରେ 2 ଗୁଣ ପାର୍ଥକ୍ୟ) |<着 变化 的 <<<p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 差异。。<着 变化 变化 <<<p <0.05 和> 2 | Значительно измененные белки выделены красным цветом (p <0,05 и> 2-кратная разница в ионной силе)। ଉଲ୍ଲେଖନୀୟ ଭାବରେ ପରିବର୍ତ୍ତିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ଲାଲ୍ ରଙ୍ଗରେ ହାଇଲାଇଟ୍ ହୋଇଛି (p <0.05 ଏବଂ> ଆୟନିକ୍ ଶକ୍ତିରେ 2 ଗୁଣ ପାର୍ଥକ୍ୟ) |HEK293T-miniSOG ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ପ୍ରୋଟିନ୍ କିନ୍ତୁ HEK293T ପାଇଁ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ ନୁହେଁ ସବୁଜ ରଙ୍ଗରେ ଦେଖାଯାଏ |b N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଏବଂ ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ ନିର୍ମାଣ ମଧ୍ୟରେ ଓଭରଲିପ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଦେଖାଉଥିବା ଭେନ ଚିତ୍ର |N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଟ୍ୟାଗ୍ଗୁଡ଼ିକ ପାର୍କିନ୍କୁ ସକ୍ରିୟ ଭାବରେ ସକ୍ରିୟ କରିପାରନ୍ତି ଏବଂ ଅଧିକ ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସୃଷ୍ଟି କରିପାରନ୍ତି |c PDPL ଏବଂ AP-MS ମଧ୍ୟରେ ଓଭରଲିପ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଦେଖାଉଥିବା ଭେନ ଚିତ୍ର |ଜଣାଶୁଣା ଇଣ୍ଟରାକ୍ଟରଗୁଡିକ ତାଲିକାଭୁକ୍ତ ହୋଇଛି, 18 ଟି ଓଭରଲିପ୍ ହୋଇଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଧ୍ୟରୁ 4 ଟି ଏବଂ PDPL ରେ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଭାବରେ ଚିହ୍ନିତ 159 ଟି ପ୍ରୋଟିନ୍ ମଧ୍ୟରୁ 11 ଟି |d LC-MS / MS ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରତିନିଧୀ ଲକ୍ଷ୍ୟଗୁଡିକ ପାଶ୍ଚାତ୍ୟ ବ୍ଲୋଟିଂ ଦ୍ୱାରା ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା |e Ssu72 ଏବଂ SNW1 କୁ ପଞ୍ଜୀକୃତ ହୋଇନଥିବା ପାର୍କିନ୍ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଭାବରେ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା |ଏହି ଫ୍ଲାଗ୍ ଟ୍ୟାଗ୍ ହୋଇଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ଲାସିମଗୁଡିକ HEK293T ଏବଂ HEK293T- ପାର୍କିନ୍-ମିନିସୋଗରେ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ପରେ ବିଭିନ୍ନ ସମୟରେ CCCP ଚିକିତ୍ସା କରାଯାଇଥିଲା |ପାର୍କିନ୍ ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ ଲାଇନରେ ଅବନତି ଅଧିକ ସ୍ପଷ୍ଟ ହୋଇଥିଲା |f ପ୍ରୋଟିଜୋମ ଇନହିବିଟର MG132 ବ୍ୟବହାର କରି, ଏହା ନିଶ୍ଚିତ ହେଲା ଯେ Ssu72 ଏବଂ SNW1 ର ଅବକ୍ଷୟ ପ୍ରକ୍ରିୟା ପ୍ରୋଟିଜୋମ-ସର୍ବବ୍ୟାପୀ ଦ୍ୱାରା ମଧ୍ୟସ୍ଥ |ଏହି ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ ସମାନ ଫଳାଫଳ ସହିତ ଅତିକମରେ ଦୁଇଥର ପୁନରାବୃତ୍ତି କରାଯାଇଥିଲା |କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ଫାଇଲ ଆକାରରେ କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଛି |
ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ, PDPL ଦ୍ୱାରା ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ପାର୍କିନ୍-ବାଇଣ୍ଡ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏବଂ ସେମାନଙ୍କର ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରିବା ଜରୁରୀ |ପଞ୍ଜୀକୃତ ହୋଇନଥିବା ପାର୍କିନ୍ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବାକୁ, ଆମେ ସାତୋଟି ଚିହ୍ନିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ଏବଂ SNW1) ଚୟନ କଲୁ ଏବଂ ଏହି ଜିନ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ସାଧାରଣ HEK293T ରେ ପ୍ରକାଶ କରିବା ପାଇଁ ଏବଂ ପ୍ଲାଜାମିଡ୍ ଟ୍ରାନ୍ସଫେକ୍ଟ କରି ମିନିସୋଗ୍-ପାର୍କିନ୍ ର HEK293T ପରେ CCCP ଚିକିତ୍ସା ଦ୍ୱାରା ପ୍ରକାଶ କଲୁ |ସ୍ଥିର ମିନିସୋଗ-ପାର୍କିନ୍ ଲାଇନରେ (ଚିତ୍ର 5e) Ssu72 ଏବଂ SNW1 ପ୍ରୋଟିନର ସ୍ତର ଯଥେଷ୍ଟ ହ୍ରାସ ପାଇଲା |12 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ CCCP ସହିତ ଚିକିତ୍ସା ଦ୍ subst ାରା ଉଭୟ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଗୁଡିକର ସବୁଠାରୁ ଖରାପ ଅବନତି ଘଟିଲା |Ssu72 ଏବଂ SNW1 ର ଅବକ୍ଷୟ ପ୍ରୋଟିଜୋମ-ସର୍ବବ୍ୟାପୀ ଦ୍ୱାରା ନିୟନ୍ତ୍ରିତ କି ନାହିଁ ତାହା ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବା ପାଇଁ, ପ୍ରୋଟିଜୋମ ଇନହିବିଟର MG132 ପ୍ରୋଟିଜୋମ କାର୍ଯ୍ୟକଳାପକୁ ପ୍ରତିରୋଧ କରିବା ପାଇଁ ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପ୍ରକୃତରେ ଆମେ ଜାଣିଲୁ ଯେ ସେମାନଙ୍କର ଅବକ୍ଷୟ ପ୍ରକ୍ରିୟା ପ୍ରତିବନ୍ଧିତ ହୋଇଛି (ଚିତ୍ର 5f) |ପାଶ୍ଚାତ୍ୟ ବ୍ଲୋଟିଂ (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 10) ବ୍ୟବହାର କରି ପାର୍କିନ୍ ଇଣ୍ଟରାକ୍ଟର ଭାବରେ ଅତିରିକ୍ତ ଅଣ-ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଲକ୍ଷ୍ୟଗୁଡିକ ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା LC-MS / MS ସହିତ ସ୍ଥିର ଫଳାଫଳ ଦେଖାଇଲା |ପରିଶେଷରେ, ଟାର୍ଗେଟ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଟ୍ରାନ୍ସଫେକ୍ସନ୍ ଯାଞ୍ଚ ସହିତ PDPL କାର୍ଯ୍ୟ ପ୍ରବାହର ଏକୀକରଣ ପଞ୍ଜୀକୃତ ହୋଇନଥିବା E3 ଲିଗେଜ୍ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଚିହ୍ନଟ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ |
ଆମେ ଏକ ସାଧାରଣ ନିକଟତର ମାର୍କିଂ ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ବିକଶିତ କରିଛୁ ଯାହା ଆପଣଙ୍କୁ ସ୍ପେସ୍ ଏବଂ ସମୟ POI ସହିତ ଯୋଗାଯୋଗ କରିବାରେ ଚିହ୍ନଟ କରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ |ପ୍ଲାଟଫର୍ମଟି ମିନିସୋଗ ଫଟୋସେନାଇଟାଇଜର ପ୍ରୋଟିନ୍ ଉପରେ ଆଧାରିତ, ଯାହା ପ୍ରାୟ 12 kDa, ପରିପକ୍ୱ APEX2 ଏନଜାଇମ୍ (27 kDa) ର ଅଧା ଆକାରରୁ କମ୍ ଏବଂ TurboID (35 kDa) ଆକାରର ଏକ ତୃତୀୟାଂଶ |ଛୋଟ ଆକାର ଛୋଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଇଣ୍ଟରାକ୍ଟୋମ୍ ଅଧ୍ୟୟନ ପାଇଁ ପ୍ରୟୋଗର ପରିସରକୁ ବହୁଗୁଣିତ କରିବା ଉଚିତ |ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନର କ୍ୱାଣ୍ଟମ୍ ଅମଳ ବୃଦ୍ଧି ଏବଂ ଏହି ପଦ୍ଧତିର ସମ୍ବେଦନଶୀଳତାକୁ ବ to ାଇବା ପାଇଁ ଜେନେଟିକ୍ ଏନକୋଡେଡ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ କିମ୍ବା ଛୋଟ ଅଣୁଗୁଡ଼ିକ ଅତିରିକ୍ତ ଫଟୋସେନାଇଟିଜରର ଅଧିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ ଆବଶ୍ୟକ |MiniSOG ର ସାମ୍ପ୍ରତିକ ସଂସ୍କରଣ ପାଇଁ, ଉଚ୍ଚତା ସାମୟିକ ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ ନିକଟତର ମାର୍କରଗୁଡିକ ସକ୍ରିୟ କରିବାକୁ ନୀଳ ଆଲୋକ ବ୍ୟବହାର କରି ହାସଲ କରାଯାଇପାରିବ |ଏହା ସହିତ, ଅଧିକ ଏକ୍ସପୋଜର ସମୟ ଏକକ ଅମ୍ଳଜାନର ଏକ ବୃହତ “କ୍ଲାଉଡ୍” ମୁକ୍ତ କଲା, ଫଳସ୍ୱରୂପ ଅଧିକ ଡିଷ୍ଟାଲ୍ ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ଅବଶିଷ୍ଟାଂଶର ପରିବର୍ତ୍ତନ, ଲେବେଲିଂ ବ୍ୟାଡ୍ୟୁସ୍ ବୃଦ୍ଧି, ଏବଂ PDPL ସ୍ପେସାଲ୍ ରିଜୋଲ୍ୟୁସନ୍ ସୁକ୍ଷ୍ମ କରିବାର କ୍ଷମତା |ସିଗନାଲ୍-ଟୁ-ବ୍ୟାକଗ୍ରାଉଣ୍ଡ ଅନୁପାତ ବ increase ାଇବା ପାଇଁ ଆମେ ସାତୋଟି ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ ମଧ୍ୟ ପରୀକ୍ଷା କରିଥିଲୁ ଏବଂ ଏହି ଉପାୟ ପଛରେ ଥିବା ମଲିକୁଲାର ଯନ୍ତ୍ରକ expl ଶଳ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିଥିଲୁ |TOP-ABPP ୱାର୍କଫ୍ଲୋ ନିରପେକ୍ଷ ଖୋଲା ସନ୍ଧାନ ସହିତ ମିଳିତ ହୋଇଛି ଯେ ନିଶ୍ଚିତ ହୋଇଛି ଯେ ପରିବର୍ତ୍ତନ କେବଳ ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ସରେ ଘଟିଛି ଏବଂ ଲୁପ୍ ଅଞ୍ଚଳରେ ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ପାଇଁ ମଧ୍ୟମ ପସନ୍ଦ ବ୍ୟତୀତ ବର୍ଦ୍ଧିତ ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ପରିବର୍ତ୍ତନ ପାଇଁ କ consist ଣସି ସ୍ଥିର ମାଇକ୍ରୋ ପରିବେଶ ପରିଲକ୍ଷିତ ହୋଇନାହିଁ |
PDPL ମଧ୍ୟ ପ୍ରୋଟେମ୍ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟତା ଏବଂ କଭରେଜ୍ ସହିତ ସବସେଲୁଲାର୍ ପ୍ରୋଟିମ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଛି, ଅତି କମରେ ଅନ୍ୟ ନିକଟତର ଲେବେଲିଂ ଏବଂ ଅର୍ଗାନେଲ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ରାସାୟନିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ ପ୍ରଣାଳୀ ସହିତ ତୁଳନାତ୍ମକ |ଭୂପୃଷ୍ଠ, ଲାଇସୋସୋମାଲ୍ ଏବଂ ସିକ୍ରେଟୋମ-ଜଡିତ ପ୍ରୋଟୋମଗୁଡିକ 46,47 କୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବା ପାଇଁ ପ୍ରକ୍ସିମିଟି ମାର୍କର୍ସ ମଧ୍ୟ ସଫଳତାର ସହିତ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଛି |ଆମେ ବିଶ୍ believe ାସ କରୁ ଯେ PDPL ଏହି ସବସେଲୁଲାର୍ ଅର୍ଗାନେଲ୍ସ ସହିତ ସୁସଙ୍ଗତ ହେବ |ଏହା ସହିତ, ଆମେ ସାଇଟୋସୋଲିକ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବାନ୍ଧିବା ପାଇଁ ଲକ୍ଷ୍ୟ ଚିହ୍ନଟ କରି PDPL କୁ ଚ୍ୟାଲେଞ୍ଜ କରିଥିଲୁ ଯାହା ଗତିଶୀଳ ଗୁଣ ଏବଂ ଅଧିକ ସାମୟିକ ପାରସ୍ପରିକ କାର୍ଯ୍ୟରେ ଜଡିତ ହେତୁ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ବନ୍ଧା ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅପେକ୍ଷା ଅଧିକ ଜଟିଳ |ଦୁଇଟି ପ୍ରୋଟିନ୍, ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପସନ୍ କୋଆକ୍ଟିଭେଟର୍ BRD4 ଏବଂ ରୋଗ ସହ ଜଡିତ ଲିଗେଜ୍ E3 ପାର୍କିନ୍ ଉପରେ PDPL ପ୍ରୟୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |ଏହି ଦୁଇଟି ପ୍ରୋଟିନ୍ କେବଳ ସେମାନଙ୍କର ମ fundamental ଳିକ ଜ bi ବିକ କାର୍ଯ୍ୟ ପାଇଁ ନୁହେଁ, ସେମାନଙ୍କର କ୍ଲିନିକାଲ୍ ପ୍ରାସଙ୍ଗିକତା ଏବଂ ଚିକିତ୍ସା ସମ୍ଭାବନା ପାଇଁ ମଧ୍ୟ ଚୟନ କରାଯାଇଥିଲା |ଏହି ଦୁଇଟି POI ପାଇଁ, ଜଣାଶୁଣା ବନ୍ଧନ ଅଂଶୀଦାର ଏବଂ ପ reg ୍ଜୀକୃତ ଲକ୍ଷ୍ୟଗୁଡିକ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା |ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ, ପର୍ଯ୍ୟାୟ ପୃଥକ-ଜଡିତ ପ୍ରୋଟିନ୍ SFPQ ସହ-ଆଇପି ଦ୍ୱାରା ନିଶ୍ଚିତ କରାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ହୁଏତ ଏକ ନୂତନ ଯନ୍ତ୍ରକ indicate ଶଳ ସୂଚାଇପାରେ ଯାହା ଦ୍ BR ାରା BRD4 (ସର୍ଟ ଆଇସୋଫର୍ମ) LLPS ନିୟନ୍ତ୍ରଣ କରିଥାଏ |ସେହି ସମୟରେ, ଆମେ ବିଶ୍ that ାସ କରୁ ଯେ ପାର୍କିନ୍ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟଗୁଡିକର ଚିହ୍ନଟ ହେଉଛି ଏକ ଦୃଶ୍ୟ ଯେଉଁଥିରେ ପରୋକ୍ଷ ଆଡେସିଭ୍ ଚିହ୍ନଟ ଆବଶ୍ୟକ |ଆମେ ଦୁଇଟି ଅଜ୍ଞାତ ପାର୍କିନ୍ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ଚିହ୍ନଟ କରି ସର୍ବବ୍ୟାପୀ-ପ୍ରୋଟିଜୋମ୍ ପଥରେ ସେମାନଙ୍କର ଅବକ୍ଷୟକୁ ନିଶ୍ଚିତ କଲୁ |ସମ୍ପ୍ରତି, ହାଇଡ୍ରୋଲେଜ୍ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ଏନଜାଇମ୍ ଦ୍ୱାରା ଫାଶ କରି ଚିହ୍ନଟ କରିବା ପାଇଁ ଏକ ଯାନ୍ତ୍ରିକ-ଆଧାରିତ ଟ୍ରାପିଙ୍ଗ୍ ରଣନୀତି ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଛି |ଯଦିଓ ଏହା ଅତ୍ୟନ୍ତ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ପଦ୍ଧତି, ଏହା ବୃହତ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ ଗଠନରେ ଜଡିତ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ ନୁହେଁ ଏବଂ ଏନଜାଇମ୍ ଏବଂ ସବଷ୍ଟ୍ରେଟ୍ ମଧ୍ୟରେ କୋଭାଲାଣ୍ଟ ବଣ୍ଡ ଗଠନ ଆବଶ୍ୟକ କରେ |ଆମେ ଆଶା କରୁ ଯେ PDPL ଅନ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ ଏବଂ ଏନଜାଇମ୍ ପରିବାର ଯେପରିକି ଡ୍ୟୁବିକ୍ୟୁଟିନାସ୍ ଏବଂ ମେଟାଲୋପ୍ରୋଟେଜ୍ ପରିବାର ଅଧ୍ୟୟନ ପାଇଁ ବିସ୍ତାର କରାଯାଇପାରିବ |
ଉନ୍ନତ ଏକକ ଅମ୍ଳଜାନ ଉତ୍ପାଦନ ସହିତ SOPP3 ନାମକ ମିନିସୋଗ୍ର ଏକ ନୂତନ ରୂପ ବିକଶିତ ହୋଇଛି |ଆମେ SOPP3 ସହିତ miniSOG କୁ ତୁଳନା କରି ଉନ୍ନତ ମାର୍କିଂ କାର୍ଯ୍ୟଦକ୍ଷତା ପାଇଲୁ, ଯଦିଓ ସଙ୍କେତ-ଶବ୍ଦ ଅନୁପାତ ଅପରିବର୍ତ୍ତିତ ରହିଲା (ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଚିତ୍ର 11) |ଆମେ ଅନୁମାନ କରିଛୁ ଯେ SOPP3 ର ଅପ୍ଟିମାଇଜେସନ୍ (ଉଦାହରଣ ସ୍ୱରୂପ, ନିର୍ଦ୍ଦେଶିତ ବିବର୍ତ୍ତନ ମାଧ୍ୟମରେ) ଅଧିକ ଦକ୍ଷ ଫଟୋସେନାଇଟାଇଜର୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଆଣିବ ଯାହାକି ହାଲୁକା ସମୟ ଆବଶ୍ୟକ କରେ ଏବଂ ଏହିପରି ଅଧିକ ଗତିଶୀଳ ସେଲୁଲାର୍ ପ୍ରକ୍ରିୟାଗୁଡ଼ିକୁ ଧରିବାକୁ ଅନୁମତି ଦିଏ |ଉଲ୍ଲେଖଯୋଗ୍ୟ, PDPL ର ସାମ୍ପ୍ରତିକ ସଂସ୍କରଣ ସେଲୁଲାର୍ ପରିବେଶରେ ସୀମିତ କାରଣ ଏହା ନୀଳ ଆଲୋକ ଆଲୋକ ଆବଶ୍ୟକ କରେ ଏବଂ ଗଭୀର ଟିସୁ ଭିତରକୁ ପ୍ରବେଶ କରିପାରିବ ନାହିଁ |ଏହି ବ feature ଶିଷ୍ଟ୍ୟ ପଶୁ ମଡେଲ ଅଧ୍ୟୟନରେ ଏହାର ବ୍ୟବହାରକୁ ରୋକିଥାଏ |ତଥାପି, PDPL ସହିତ ଅପ୍ଟୋଜେନେଟିକ୍ସର ମିଶ୍ରଣ ପଶୁ ଗବେଷଣା ପାଇଁ ବିଶେଷ କରି ମସ୍ତିଷ୍କରେ ସୁଯୋଗ ଦେଇପାରେ |ଏହା ସହିତ, ଅନ୍ୟ ଇଞ୍ଜିନିୟରିଂ ଇନଫ୍ରାଡ୍ ଫଟୋସେନାଇଟିଜର୍ ମଧ୍ୟ ଏହି ସୀମାକୁ ହଟାଇଥାଏ |ବର୍ତ୍ତମାନ ଏହି କ୍ଷେତ୍ରରେ ଅନୁସନ୍ଧାନ ଚାଲିଛି।
HEK293T ସେଲ୍ ଲାଇନ୍ ATCC (CRL-3216) ରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା |ମାଇକୋପ୍ଲାଜମା ସଂକ୍ରମଣ ପାଇଁ ସେଲ୍ ଲାଇନ୍ ନକାରାତ୍ମକ ପରୀକ୍ଷଣ କରିଥିଲା ​​ଏବଂ DMEM (ଥର୍ମୋ, # C11995500BT) ରେ 10% ଭ୍ରୁଣ ବୋଭାଇନ୍ ସେରମ୍ (FBS, ଭିଷ୍ଟେକ୍, # SE100-B) ଏବଂ 1% ପେନିସିଲିନ୍ / ଷ୍ଟ୍ରେପଟୋମାଇସିନ୍ (ହାଇକ୍ଲୋନ୍, # SV30010) ରେ ସଂସ୍କୃତି ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା |ବ grown ଼ିଲା
3-ଆମିନୋଫେନିଲିନ୍ (ନମୁନା 3) ଏବଂ (4-ଇଥିନିଲଫେନିଲ) ମିଥାନାମାଇନ୍ (ନମୁନା 4) ବିଡେଫର୍ମରୁ କ୍ରୟ କରାଯାଇଥିଲା |ଏନର୍ଜି-ରାସାୟନିକ ପଦାର୍ଥରୁ ପ୍ରୋପିଲାମାଇନ୍ (ପ୍ରୋବ 2) କ୍ରୟ କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରକାଶିତ ପଦ୍ଧତି ଅନୁଯାୟୀ N- (2-ଆମିନୋଫେନିଲ) ପେଣ୍ଟ -4-ବିଶ୍ୱାସାଇଡ୍ (ପ୍ରୋବ 1) ସିନ୍ଥାଇଜ୍ ହୋଇଥିଲା |
ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟାରୀ ଟେବୁଲ୍ 1 ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ବ୍ୟବହୃତ ଜେନେଟିକ୍ ଗଠନଗୁଡ଼ିକୁ ତାଲିକାଭୁକ୍ତ କରେ |ପି ଜୋ (ପାଇକ ୟୁନିଭରସିଟି) ର ଏକ ଉପହାର ପ୍ଲାସିମରୁ ମିନିସୋଗ୍ ଏବଂ କିଲର୍ ରେଡ୍ କ୍ରମଗୁଡିକ କ୍ଲୋନ କରାଯାଇଥିଲା |ମାଇଟୋକଣ୍ଡ୍ରିଆଲ୍ ମ୍ୟାଟ୍ରିକ୍ସ ଟାର୍ଗେଟ୍ କ୍ରମ COX4 ର 23 N- ଟର୍ମିନାଲ୍ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ ରୁ ଉତ୍ପନ୍ନ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ଗିବସନ୍ ଆସେମ୍ବଲି (ବିୟୋଟାଇମ୍, # D7010S) ବ୍ୟବହାର କରି ସୂଚିତ ଭେକ୍ଟରରେ କ୍ଲୋନ କରାଯାଇଥିଲା |ଏଣ୍ଡୋପ୍ଲାଜାମିକ୍ ରେଟିକୁଲମ୍ ର ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ଏବଂ ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟସକୁ ଟାର୍ଗେଟ୍ କରିବାକୁ, SEC61B ମାନବ DNA (NM_006808.3) (NEB, # M0491L) HEK293T କୋଷଗୁଡ଼ିକର cDNA ଲାଇବ୍ରେରୀରୁ PCR ଦ୍ pl ାରା ବ pl ଼ାଯାଇଥାଏ ଏବଂ H2B DNA (ଡି। ଲିନ, ଶେନଜେନ୍ ବାଇ ଲାବୋରେଟୋରୀ ଦ୍ୱାରା ଦାନ କରାଯାଇଥିଲା) | ଏବଂ ଉପରୋକ୍ତ ପରି କ୍ଲୋନ ହୋଇଛି |ଅନ୍ୟଥା ସୂଚିତ ନହେଲେ, ଟ୍ରାନ୍ସଫେକ୍ସନ୍ ଏବଂ ସ୍ଥିର ସେଲ୍ ଲାଇନ୍ ନିର୍ମାଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ଅନ୍ୟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଜିନ୍ ଗୁଡିକ HEK293T ସେଲ୍ cDNA ଲାଇବ୍ରେରୀରୁ PCR ବୃଦ୍ଧି କରାଯାଇଥିଲା |G3S (GGGS) ଏବଂ G4S (GGGGS) ବାଟ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଏବଂ ମିନିସୋଗ ମଧ୍ୟରେ ଲିଙ୍କର୍ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହେଉଥିଲା |ଏହି ଫ୍ୟୁଜନ୍ ନିର୍ମାଣରେ ଏକ V5 ଏପିଟୋପ୍ ଟ୍ୟାଗ୍ (GKPIPNPLLGLDST) ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |ସ୍ତନ୍ୟପାୟୀ ପ୍ରାଣୀମାନଙ୍କରେ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ଏବଂ ଏକ ସ୍ଥିର ସେଲ୍ ରେଖା ପ୍ରତିଷ୍ଠା ପାଇଁ, ମିନିଏସୋଗ୍ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ନିର୍ମାଣକୁ pLX304 ଲେଣ୍ଟିଭାଇରାଲ୍ ଭେକ୍ଟରରେ ସବକ୍ଲୋନ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ଜୀବାଣୁ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ପାଇଁ, ମିନି- SOG କୁ C- ଟର୍ମିନାସରେ 6xHis ନାମକ pET21a ଭେକ୍ଟରରେ କ୍ଲୋନ କରାଯାଇଥିଲା |
HEK293T କୋଷଗୁଡିକ ଛଅ କୂଅ ପ୍ଲେଟରେ ପ୍ରତି କୂଅରେ 2.0 x 105 କୋଷରେ ବିହନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 24 ଘଣ୍ଟା ପରେ ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ଲେଣ୍ଟିଭାଇରାଲ୍ ପ୍ଲାସିମିଡ୍ (2.4 μg pLX304) ଏବଂ ଭାଇରାଲ୍ ପ୍ୟାକେଜିଂ ପ୍ଲାସିମିଡ୍ (1.5 μg psPAX2 ଏବଂ 1.2 μg pMD2.G) ସହିତ ଲିପୋ 8000 (ବିୟୋଟାଇମ୍) ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା | , # C0533), ପ୍ରାୟ 80% ଫ୍ୟୁଜନ୍ |ରାତାରାତି ସଂକ୍ରମଣ ପରେ, ମାଧ୍ୟମକୁ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଅନ୍ୟ 24 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ଜୀବାଣୁ ସଂଗ୍ରହ 24, 48 ଏବଂ 72 ଘଣ୍ଟା ପରେ କରାଯାଇଥିଲା |ଟାର୍ଗେଟ୍ ସେଲ୍ ଲାଇନଗୁଡିକର ସଂକ୍ରମଣ ପୂର୍ବରୁ, ଭାଇରାଲ୍ ମାଧ୍ୟମକୁ 0.8 μm ଫିଲ୍ଟର୍ (ମର୍କ, # ମିଲେକ୍ସ-ଜିପି) ମାଧ୍ୟମରେ ଫିଲ୍ଟର୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପଲିବ୍ରେନ୍ (ସୋଲାରବିଓ, # H8761) 8 μg / ml ର ଏକାଗ୍ରତାରେ ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |24 ଘଣ୍ଟା ପରେ, କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ମାଧ୍ୟମ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରି ପୁନରୁଦ୍ଧାର ପାଇଁ ଅନୁମତି ଦିଆଗଲା |ନିମ୍ନ କଠିନ ଚୟନ ଭାବରେ ପ୍ରଥମ ତିନୋଟି ପାସ୍ ପାଇଁ 5 μg / ml ବ୍ଲାଷ୍ଟିସିଡିନ୍ (ସୋଲାରବିଓ, # 3513-03-9) ବ୍ୟବହାର କରି କକ୍ଷଗୁଡିକ ଚୟନ କରାଯାଇଥିଲା |ତା’ପରେ ପରବର୍ତ୍ତୀ ତିନୋଟି ପାସ୍ ପାଇଁ ଅଧିକ କଠୋର ବ୍ୟବସ୍ଥା ଭାବରେ 20 μg / ml ବ୍ୟବହାର କଲେ |
କୂଅରେ ପ୍ରାୟ 20,000 କୋଷର ଘନତ୍ୱରେ 12-କୂଅ ଚାମ୍ବର (ଇବିଡି, # 81201) ରେ କୋଷଗୁଡିକ ବିହନ କରାଯାଇଥିଲା |HEK293T କୋଷଗୁଡ଼ିକର ଆଡିଶିନ୍ରେ ଉନ୍ନତି ଆଣିବା ପାଇଁ, 37 ° C ରେ ଫସଫେଟ୍ ବଫର୍ଡ ସାଲାଇନ୍ (ପିବିଏସ୍, ସାଙ୍ଗନ୍, # B640435) ରେ ମିଶ୍ରିତ 50 µg / ml ଫାଇବ୍ରୋନେକ୍ଟିନ୍ (କର୍ନିଙ୍ଗ, # 356008) ଯୋଗ କରନ୍ତୁ |ଚାମ୍ବରଗୁଡିକ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପରେ ପିବିଏସ୍ ସହିତ ଅପସାରଣ କରାଯାଇଥିଲା |24 ଘଣ୍ଟା ପରେ, କୋଷଗୁଡିକ PBS ସହିତ ଥରେ ଧୋଇ ଦିଆଗଲା, ତାଜା ହ୍ୟାଙ୍କ ସନ୍ତୁଳିତ ଲୁଣ ଦ୍ରବଣରେ (HBSS, Gibco, # 14025092) 37 ମିଟରରେ 1 ଘଣ୍ଟା ଯାଞ୍ଚ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପରେ ନୀଳ ଏଲଇଡି (460 nm) ରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ ହେଲା | )) କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ବିକିରଣ କରାଯାଇଥିଲା |ଏହା ପରେ, କୋଷଗୁଡିକ PBS ସହିତ ଦୁଇଥର ଧୋଇ ଦିଆଗଲା ଏବଂ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 15 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ PBS (ସାଙ୍ଗନ୍, # E672002) ରେ 4% ଫର୍ମାଲଡିହାଇଡ୍ ସହିତ ସ୍ଥିର କରାଯାଇଥିଲା |ଅଧିକ ଫର୍ମାଲଡିହାଇଡ୍ ସ୍ଥିର କୋଷରୁ ପିବିଏସ୍ ସହିତ ତିନିଥର ଧୋଇ ବାହାର କରାଯାଇଥିଲା |ସେଲ୍ ଗୁଡିକ ପରେ PBS ରେ 0.5% Triton X-100 (Sangon, # A600198) ସହିତ ବିସ୍ତାର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ PBS ସହିତ 3 ଥର ଧୋଇଗଲା |ତା’ପରେ ଚାମ୍ବରକୁ କା remove ଼ନ୍ତୁ ଏବଂ ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନାରେ 25 µl କ୍ଲିକ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମିଶ୍ରଣରେ 50 µM Cy3-azide (ଆଲାଦ୍ଦିନ, # C196720), 2 ମିଟର CuSO4 (ସାଙ୍ଗନ୍, # A603008), 1 ମିଟର BTTAA (କନଫ୍ଲୋର, # BDJ-4) ଯୋଗ କରନ୍ତୁ | ଏବଂ mg। mg ମିଗ୍ରା / ମିଲି ସୋଡିୟମ୍ ଆସ୍କର୍ବେଟ୍ (ଆଲାଦ୍ଦିନ, ନଂ। S105024) ଏବଂ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ସ୍ନାପ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରେ, 0.05% Tween-20 (ସାଙ୍ଗନ୍, # A600560) (PBST) ଧାରଣ କରିଥିବା PBS ସହିତ କୋଷଗୁଡିକ ଛଅ ଥର ଧୋଇ ଦିଆଗଲା ଏବଂ ପରେ 5% BSA (Abcone, # B24726) ସହିତ PBST ରେ 30 ମିନିଟ୍ ରୁମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ ଅବରୋଧ କରାଯାଇଥିଲା |
କୋଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ ଇମ୍ୟୁନୋଷ୍ଟାଇନ୍ ପାଇଁ, ସୂଚିତ ସର୍ତ୍ତ ଅନୁଯାୟୀ ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ କୋଷଗୁଡିକ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା: ମାଉସ୍ ଆଣ୍ଟି- V5 ଟ୍ୟାଗ୍ mAb (1: 500, CST, # 80076), ରାବଣ ଆଣ୍ଟି- Hsp60 mAb (1: 1000), ABclonal, # A0564), ରାତାରାତି 4 ° C ରେ ରାବଣ ପଲିକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟି-କାଲନେକ୍ସିନ ଆଣ୍ଟିବଡି (1: 500, ଆବକାମ, # ab22595) କିମ୍ବା ରାବଣ ଆଣ୍ଟି-ଲାମିନ ଏ / ସି ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟିବଡି (1: 500; CST, # 2032)PBST ସହିତ 3 ଥର ଧୋଇବା ପରେ, କୋଷଗୁଡିକ ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା: ଛେଳି ଆଣ୍ଟି ରାବଟ୍ ଆଲେକ୍ସା ଫ୍ଲୋର 488 (ଥର୍ମୋ, # A11034) 1: 1000, ଛେଳି ଆଣ୍ଟି ମାଉସ୍ ଆଲେକ୍ସା ଫ୍ଲୋର 594 (CST, # 8889) 1: 1000 ମିଶ୍ରିତ |30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ ମିଶ୍ରିତ କରନ୍ତୁ |ସେଲ୍ ଗୁଡିକ PBST ସହିତ 3 ଥର ଧୋଇ ଦିଆଗଲା ଏବଂ ରୁମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ PBS ରେ DAPI (ଥର୍ମୋ, # D1306) ସହିତ ପ୍ରତିରୋଧ କରାଯାଇଥିଲା |ପିବିଏସ୍ ସହିତ 3 ଧୋଇବା ପରେ, ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ ପାଇଁ PBS ରେ 50% ଗ୍ଲାଇସେରଲ୍ (ସାଙ୍ଗନ୍, # A600232) ରେ କୋଷଗୁଡିକ ସିଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ଏକ ZEISS LSM 900 Airyscan2 କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ଏବଂ ZNE 3.5 ସଫ୍ଟୱେର୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଇମ୍ୟୁନୋଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ପ୍ରତିଛବିଗୁଡ଼ିକ ମିଳିଲା |
ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ଇମେଜିଙ୍ଗ୍ ପାଇଁ, ହଙ୍କସ୍ HEPES ବଫର୍ (DOJINDO, # MT05) ରେ 100 nM Si-DMA ଯୋଡିବା ପୂର୍ବରୁ ହ୍ୟାଙ୍କସ୍ HEPES ବଫର୍ ସହିତ କୋଷଗୁଡିକ ଦୁଇଥର ଧୋଇଗଲା |ଆଲୋକର ସଂସ୍ପର୍ଶରେ ଆସିବା ପରେ, କୋଷଗୁଡିକ CO2 ଇନକ୍ୟୁବେଟରରେ 37 ° C ରେ 45 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |କକ୍ଷଗୁଡ଼ିକ ପରେ ହ୍ୟାଙ୍କ୍ସର HEPES ବଫର୍ ସହିତ ଦୁଇଥର ଧୋଇ ଦିଆଗଲା ଏବଂ ରୁମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ହ୍ୟାଙ୍କ୍ସର HEPES ବଫର୍ରେ ହୋଚ୍ଷ୍ଟ ସହିତ ପ୍ରତିରୋଧ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ZEISS LSM 900 କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଭିଜୁଆଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା |, # M36008) କ୍ୟାଲସିୟମ୍ ଏବଂ ମ୍ୟାଗ୍ନେସିୟମ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା HBSS ବଫର୍ ରେ |ଆଲୋକ କିମ୍ବା ଡକ୍ସୋରୁବାଇସିନ୍ (MCE, # HY-15142A) ର ସଂସ୍ପର୍ଶରେ ଆସିବା ପରେ, କୋଷଗୁଡିକ CO2 ଇନକ୍ୟୁବେଟରରେ 37 ° C ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା, HBSS ବଫର୍ ସହିତ ଦୁଇଥର ଧୋଇ ଦିଆଗଲା ଏବଂ ରୁମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ HBSS ବଫର୍ରେ ହୋଚ୍ ସହିତ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ମିନିଟ୍ |ଡକ୍ସୋରୁବାଇସିନ୍ ଏକ ସକରାତ୍ମକ ଯାଞ୍ଚ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଭାବରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା ଯେଉଁଠାରେ HBSS ରେ 20 μM ଡକ୍ସୋରୁବାଇସିନ୍ ସହିତ କୋଷଗୁଡିକ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 1% BSA ଧାରଣ କରିଥିଲା ​​|ଏକ Zeiss LSM 900 କନଫୋକାଲ୍ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଇମ୍ୟୁନୋଫ୍ଲୋରୋସେଣ୍ଟ୍ ପ୍ରତିଛବିଗୁଡ଼ିକ ମିଳିଥିଲା ​​|
HEK293T କୋଷଗୁଡ଼ିକ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ମାଇଟୋ-ମିନିସୋଗ୍ ପ୍ରକାଶ କରୁଥିବା 15 ସେମି ପାତ୍ରରେ ପ୍ରାୟ 30% ଘନତ୍ୱରେ ବିହନ କରାଯାଇଥିଲା |48 ଘଣ୍ଟା ପରେ, ଯେତେବେଳେ ~ 80% ମିଳନ ହେଲା, କୋଷଗୁଡିକ ପିବିଏସ୍ ସହିତ ଥରେ ଧୋଇଗଲା, ତାଜା HBSS ବଫର୍ରେ 1 ମିମି ପ୍ରୋବ 3 ସହିତ 37 ° C ରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନକ୍ୟୁବେଡ୍ ହେଲା ଏବଂ ତା’ପରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଏକ ନୀଳ ଏଲଇଡି ସହିତ ଆଲୋକିତ ହେଲା | ତାପମାତ୍ରା।ତା’ପରେ, କୋଷଗୁଡିକ PBS ସହିତ ଦୁଇଥର ଧୋଇ ଦିଆଗଲା, ସ୍କ୍ରାପ୍ ହୋଇ ବରଫ-ଥଣ୍ଡା PBS ବଫର୍ରେ EDTA ମୁକ୍ତ ପ୍ରୋଟିଜ୍ ଇନହିବିଟର (MCE, # HY-K0011) ଧାରଣ କଲା |କକ୍ଷଗୁଡିକ 1 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ସୋନିକେଟ୍ କରି ଲାଇସେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା (1 ସେକେଣ୍ଡ୍ ଏବଂ 35% ଏମ୍ପିଲିଟ୍ୟୁଡ୍ ରେ 1 ସେକେଣ୍ଡ୍ ଅଫ୍) |ଫଳସ୍ୱରୂପ ମିଶ୍ରଣକୁ 15,871 xg ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 4 ° C ରେ ଆବର୍ଜନା ହଟାଇବା ପାଇଁ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ଅଲ ern କିକ ଏକାଗ୍ରତା BCA ପ୍ରୋଟିନ୍ ଆସେ କିଟ୍ (ବିୟୋଟାଇମ୍, # P0009) ବ୍ୟବହାର କରି 4 ମିଗ୍ରା / ମିଏଲ୍ ରେ ସଜାଡି ହୋଇଗଲା |ଉପରୋକ୍ତ ଲାଇସେଟ୍ ର 1 ମି.ଲି. କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଘୂର୍ଣ୍ଣନ |ସ୍ନାପ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରେ, ମିଶ୍ରଣକୁ 10 ମିଲି ଗ୍ଲାସ୍ ପାତ୍ରରେ ପ୍ରି-ମିଶ୍ରିତ ସମାଧାନରେ ମିଶାନ୍ତୁ (MeOH: CHCl3: H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) |ନମୁନାଗୁଡିକ ମିଶ୍ରିତ ହୋଇ ରୁମ୍ ତାପମାତ୍ରାରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 4500 ଗ୍ରାମରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ନିମ୍ନ ଏବଂ ଉପର ସମାଧାନଗୁଡିକ ପରିତ୍ୟାଗ କରାଯାଇଥିଲା, ବର୍ଷା ଦୁଇଥର 1 ମିଲି ମିଥାନୋଲ ସହିତ ଧୋଇଗଲା ଏବଂ 15871 × g ରେ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 4 ° C ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗଡ୍ ହେଲା |25 ମିଟର ଆମୋନିୟମ୍ ବାଇକାର୍ବୋନାଟ୍ (ଏବିସି, ଆଲାଦ୍ଦିନ, ନଂ A110539) ରେ 1 ମିଲ୍ ୟୁରିଆ (ଆଲାଦ୍ଦିନ, ନଂ U111902) ମିଶାନ୍ତୁ |ନମୁନାଗୁଡିକ 10 ମିଟର ଡିଥିଓଥ୍ରାଇଟୋଲ (ସାଙ୍ଗନ୍, 25 ମି ଏମସିରେ # A100281) ସହିତ 40 ° C ରେ 40 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ପୁନ stit ନିର୍ମାଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପରେ ଅନ୍ଧାରରେ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 15 ମିଟର ତାଜା ଆୟୋଡୋସେଟାମାଇଡ୍ (ସାଙ୍ଗନ୍, # A600539) ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |30 ମିନିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ଆଲକାଇଲେସନ୍ |।ପ୍ରତିକ୍ରିୟାକୁ ବନ୍ଦ କରିବା ପାଇଁ ଅତିରିକ୍ତ 5 ମିମି ଡିଥିଓଥ୍ରାଇଟୋଲ୍ ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରତ୍ୟେକ ନମୁନା ପାଇଁ ପାଖାପାଖି 100 µl NeutrAvidin agarose beads (ଥର୍ମୋ, # 29202) 1 ମିଲି PBS ସହିତ 3 ଥର ଧୋଇ ପ୍ରସ୍ତୁତ କରନ୍ତୁ |ଉପରୋକ୍ତ ପ୍ରୋଟୋମ ସଲ୍ୟୁସନ୍ ml ୦ ମି.ଲି.ଏହା ପରେ ବିଡିଗୁଡିକ 3 ମିଲି ମିଟର ପିବିଏସ୍ ସହିତ 0.2% SDS (ସାଙ୍ଗନ୍, # A600485), 3 ଥର 1 ମି ୟୁରିଆ ଧାରଣ କରିଥିବା 5 ମିଲି ପିବିଏସ୍ ସହିତ ଏବଂ 3 ଥର 5 ମିଲି ddH2O ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଗଲା |ପରେ ବିଡିଗୁଡିକ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗେସନ୍ ଦ୍ harvest ାରା ଅମଳ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 25 ମିଟର ABC ର 200 μl ରେ 1 M ୟୁରିଆ, 1 ମିଟର CaCl 2 (ମାକଲିନ୍, # C805228) ଏବଂ 20 ng / μl ଟ୍ରାଇପିସିନ୍ (ପ୍ରୋମେଗା, # V5280) ରେ ପୁନ us ପଠାଯାଇଥିଲା |ଘୂର୍ଣ୍ଣନ ସହିତ 37 ° C ରେ ରାତାରାତି ଟ୍ରାଇପସିନାଇଜ୍ କରନ୍ତୁ |PH 2-3 ରେ ପହଞ୍ଚିବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଫର୍ମିକ୍ ଏସିଡ୍ (ଥର୍ମୋ, # A117-50) ଯୋଗ କରି ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବନ୍ଦ ହୋଇଗଲା |ବିଡିକୁ 3 ମିଲି ମିଟର ପିବିଏସ୍ ସହିତ 0.2% SDS ଧାରଣ କରିଥିବା ବେଳେ 3 ଥର 1 ମି ୟୁରିଆ ଧାରଣ କରିଥିବା 1 ମି.ଲି.ସଂଶୋଧିତ ପେପ୍ଟାଇଡଗୁଡିକ ହାଲୁକା ଲାଇସିସ୍ (365 nm) ଦ୍ 90 ାରା 90 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 70% MeOH ର 200 μl ବ୍ୟବହାର କରି ମୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗେସନ୍ ପରେ ଅଲ ern କିକ ଶକ୍ତି ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା |ତାପରେ ବିଡିଗୁଡିକ 100 μl 70% MeOH ସହିତ ଥରେ ଧୋଇ ଦିଆଗଲା ଏବଂ ଅଲ ern କିକ ପଦାର୍ଥଗୁଡିକ ପୁଲ ହୋଇଗଲା |ନମୁନାଗୁଡିକ ଏକ ସ୍ପିଡଭ୍ୟାକ୍ ଭ୍ୟାକ୍ୟୁମ୍ ଏକାଗ୍ରତାରେ ଶୁଖାଯାଇ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ -20 ° C ରେ ଗଚ୍ଛିତ କରାଯାଇଥିଲା |
ସିଙ୍ଗଲେଟ୍ ଅମ୍ଳଜାନ ରୂପାନ୍ତରିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଚିହ୍ନଟ ଏବଂ ପରିମାଣ କରିବା ପାଇଁ, ନମୁନାଗୁଡିକ 0.1% ଫର୍ମିକ୍ ଏସିଡ୍ ରେ ପୁନ ol ସମାଧାନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଭେଣ୍ଡର ସଫ୍ଟୱେର୍ 4.3 ରୁ ଟ୍ୟୁନ୍ ଏବଂ Xcalibur ରୁ ନାନୋ ESI ଉତ୍ସ ସହିତ ସଜ୍ଜିତ ଏକ ଅର୍ବିଟ୍ରାପ୍ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଲୁମୋସ୍ ଟ୍ରିବ୍ରିଡ୍ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର ବ୍ୟବହାର କରି 1 μg ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |ନମୁନାଗୁଡିକ 75 µm × 15 ସେମି ଆଭ୍ୟନ୍ତରୀଣ ପ୍ୟାକ୍ ହୋଇଥିବା କ୍ୟାପିଲାରୀ ସ୍ତମ୍ଭରେ 3 µm C18 ସାମଗ୍ରୀ (ReproSil-pur, # r13.b9।) ସହିତ ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଏକ EASY-nLC 1200 UHPLC ସିଷ୍ଟମ୍ (ଥର୍ମୋ) ସହିତ ସଂଯୁକ୍ତ |ପେପ୍ଟାଇଡସ୍ ର line ଖ୍ୟ 95 ମିନିଟ୍ ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍ କ୍ରୋମାଟୋଗ୍ରାଫି ଦ୍ 8 ାରା 8% ଦ୍ରବଣକାରୀ B ରୁ 50% ଦ୍ରବଣକାରୀ B (A = 0.1% ଫର୍ମିକ୍ ଏସିଡ୍, 80% ଏସିଟୋନିଟ୍ରିଲରେ B = 0.1% ଫର୍ମିକ୍ ଏସିଡ୍) ଦ୍ separated ାରା ପୃଥକ କରାଯାଇଥିଲା, ତାପରେ ଧାଡ଼ିରେ 98% B ମିନିଟକୁ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା | 300 nl / ମିନିଟ୍ ର ପ୍ରବାହ ହାରରେ 6 ମିନିଟ୍ ରେ |Orbitrap Fusion Lumos ତଥ୍ୟ ଉପରେ ନିର୍ଭର କରି ପୂର୍ଣ୍ଣ MS ସ୍କାନ୍ ଏବଂ MS2 ସ୍କାନ୍ ମଧ୍ୟରେ ବିକଳ୍ପ ଭାବରେ ତଥ୍ୟ ସଂଗ୍ରହ କରେ |ସ୍ପୁଟର୍ ଭୋଲଟେଜ୍ 2.1 kV ରେ ସ୍ଥିର ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ଆୟନ ପରିବହନ କ୍ୟାପିଲାରୀର ତାପମାତ୍ରା 320 ° C ଥିଲା |MS ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା (350-2000 ମି / z) 120,000, AGC 4 × 105 ରେଜୋଲୁସନ ଏବଂ ସର୍ବାଧିକ ଇନପୁଟ୍ ସମୟ 150 ମି।ପ୍ରତ୍ୟେକ ପୂର୍ଣ୍ଣ ସ୍କାନରେ ଥିବା 10 ଟି ସାଧାରଣ ମଲ୍ଟିପଲ୍ ଚାର୍ଜ ହୋଇଥିବା ପୂର୍ବା ors ୍ଚଳଗୁଡିକ HCD ବ୍ୟବହାର କରି 30% ର ଏକ ସାଧାରଣ ଧକ୍କା ଶକ୍ତି, 1.6 m / z ର ଏକ ଚତୁର୍ଥାଂଶ ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା ୱିଣ୍ଡୋ ଏବଂ 30,000 ରେଜୋଲୁସନ ସେଟିଂ ସହିତ ଖଣ୍ଡବିଖଣ୍ଡିତ ହୋଇଥିଲା |5 × 104 ଏବଂ ସର୍ବାଧିକ ଇନପୁଟ୍ ସମୟ 150 ମିସ ବ୍ୟବହାର କରି ଟାଣ୍ଡେମ୍ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି ପାଇଁ ଏକ AGC ଲକ୍ଷ୍ୟ |ଗତିଶୀଳ ବ୍ୟତିକ୍ରମ 30 ସେକେଣ୍ଡରେ ସେଟ୍ ହୋଇଛି | ଅଣସଂରକ୍ଷିତ ଆୟନ କିମ୍ବା 1+ ଏବଂ> 7+ ଚାର୍ଜ ଥିବା ବ୍ୟକ୍ତିମାନେ MS / MS ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟାଖ୍ୟାନ ହୋଇଥିଲେ | ଅଣସଂରକ୍ଷିତ ଆୟନ କିମ୍ବା 1+ ଏବଂ> 7+ ଚାର୍ଜ ଥିବା ବ୍ୟକ୍ତିମାନେ MS / MS ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟାଖ୍ୟାନ ହୋଇଥିଲେ | Неназначенные ионы или ион с сярядом 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС। 1+ ଏବଂ> 7+ ଚାର୍ଜ ସହିତ ଅଣସଂରକ୍ଷିତ ଆୟନ କିମ୍ବା ଆୟନଗୁଡିକ MS / MS ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟାଖ୍ୟାନ କରାଯାଇଥିଲା |+ 指定 的 离子 或 + + 1+ 和> 7+ 的 离子 被 用于 MS / MS。+ 指定 的 离子 或 + + 1+ 和> 7+ 的 离子 被 用于 MS / MS。 Нукаканные ионы или ион с сарядами 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС। 1+ ଏବଂ> 7+ ଚାର୍ଜ ସହିତ ଅଜ୍ଞାତ ଆୟନ କିମ୍ବା ଆୟନଗୁଡିକ MS / MS ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟାଖ୍ୟାନ କରାଯାଇଥିଲା |
କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ MSFragger ଉପରେ ଆଧାର କରି ଫ୍ରାଗପାଇପ୍ ଗଣନା ପ୍ଲାଟଫର୍ମ ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରକ୍ରିୟାକରଣ କରାଯାଏ |ମାସ ପକ୍ଷପାତ ଏବଂ ଅନୁରୂପ ଆମିନୋ ଏସିଡ୍ -150 ରୁ 500 Da ର ଏକ ପୂର୍ବ ସନ୍ଧାନ ସହନଶୀଳତା ସହିତ ଏକ ଖୋଲା ସନ୍ଧାନ ଆଲଗୋରିଦମ ବ୍ୟବହାର କରି ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |ପରେ ପିଡିରେ +229.0964 ଏବଂ +247.1069 ଡା (ହିଷ୍ଟାଇଡାଇନ୍ ମୋଡିଫିକେସନ୍) ବ୍ୟବହାର କରି ପରିବର୍ତ୍ତିତ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା |
ଫ୍ୟୁଜ୍ ହୋଇଥିବା ମିନିସୋଗ୍ ଜିନ୍ କୁ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ଦର୍ଶାଉଥିବା କକ୍ଷଗୁଡିକ 6 ସେମି ଡିସ୍ ରେ ଧରାଯାଇଥିଲା |~ 80% ମିଳନ ସ୍ଥଳରେ ପହଞ୍ଚିବା ପରେ, କୋଷଗୁଡିକ HBSS (Gibco, # 14025092) ସହିତ ଥରେ ଧୋଇଗଲା, ତାପରେ HBSS ରେ ରାସାୟନିକ ପ୍ରୋବ ସହିତ 37 ° C ରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ନୀଳ ଆଲୋକରେ ଆଲୋକିତ ହେଲା |କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 20 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 10W LED |PDPL, 0.5 mM ଭିଟାମିନ୍ C (MCE, # HY-B0166), 5 ମିମି ଟ୍ରୋଲକ୍ସ (MCE, # HY-101445), D2O (ସିଗମା, # 7789-20-0) ରେ କେଉଁ ପ୍ରକାରର ପ୍ରତିକ୍ରିୟାଶୀଳ ଅମ୍ଳଜାନ ପ୍ରଜାତି ଜଡିତ ତାହା ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବାକୁ | 100 ମିଟର ମ୍ୟାନିଟୋଲ (ଶକ୍ତି ରାସାୟନିକ, # 69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ ଭାବରେ କୋଷରେ ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |ଥଣ୍ଡା ପିବିଏସ୍ ସହିତ ଧୋଇବା ପରେ, କୋଷଗୁଡିକ ସ୍କ୍ରାପ୍ କରାଯାଇଥିଲା, 1.5 ମିଲି ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଜ୍ ଟ୍ୟୁବରେ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ EDTA ବିନା 1x ପ୍ରୋଟେଜ୍ ଇନହିବିଟର ସହିତ 200 μl PBS ରେ 1 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଏକ ଟିପ୍ ସହିତ ସୋନିକେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ଫଳସ୍ୱରୂପ ଏହି ମିଶ୍ରଣକୁ 15,871 × g ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 4 ° C ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଅଲ ern କିକ ଏକାଗ୍ରତା BCA ପ୍ରୋଟିନ୍ ଆସେ କିଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରି 1 ମିଗ୍ରା / ମିଏଲ୍ ରେ ସଜାଡି ଦିଆଗଲା |ଉପରୋକ୍ତ ଲାଇସେଟ୍ ର ପ୍ରାୟ 50 µl 0.1 ମିଟର ରୋଡାମାଇନ୍ ଆଜାଇଡ୍ (ଆଲାଦ୍ଦିନ, ନଂ।କ୍ଲିକ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରେ, ନମୁନାରେ 250 μl ପ୍ରି-ଥଣ୍ଡା ହୋଇଥିବା ଏସିଟୋନ୍ ମିଶାଇ, 20 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ -20 ° C ରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଡ୍ ଏବଂ 6010 × g ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 4 ° C ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗିଂ କରି ଏସିଟୋନ୍ ସହିତ ବୃଷ୍ଟିପାତ କରାଯାଇଥିଲା |ପେଲେଟ ସଂଗ୍ରହ କରନ୍ତୁ ଏବଂ 1x ଲେମଲିର ବଫରର 50 µl ରେ 10 ମିନିଟରେ 95 ° C ରେ ଫୁଟାନ୍ତୁ।ପରେ ନମୁନାଗୁଡ଼ିକୁ SDS-PAGE ଲମ୍ବା ଜେଲରେ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଇମେଜ୍ ଲ୍ୟାବ୍ ଟଚ୍ ସଫ୍ଟୱେର୍ ସହିତ ବାୟୋ-ରେଡ୍ କେମିଡୋକ ସାଂସଦ ଟଚ୍ ଇମେଜିଂ ସିଷ୍ଟମ ବ୍ୟବହାର କରି ଭିଜୁଆଲାଇଜ୍ କରାଯାଇଥିଲା |
ରେକମ୍ବିନାଣ୍ଟ ମିନି SOG-6x ତାଙ୍କର ପ୍ରୋଟିନର ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି ଏବଂ ଶୁଦ୍ଧତା ପୂର୍ବରୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ ପରି କରାଯାଇଥିଲା |ସଂକ୍ଷେପରେ, E. coli BL21 (DE3) କୋଷଗୁଡିକ (ଟ୍ରାନ୍ସଜେନ୍, # CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis ସହିତ ରୂପାନ୍ତରିତ ହେଲା ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଅଭିବ୍ୟକ୍ତି 0.5 ମିଟର IPTG (ସାଙ୍ଗନ୍, # A600168) ସହିତ ପ୍ରେରିତ ହେଲା |ସେଲ୍ ଲାଇସିସ୍ ପରେ, Ni-NTA ଅଗରୋଜ୍ ବିଡି (MCE, ନଂ।
ଆଣ୍ଟିବଡି-ଆଧାରିତ ଇନ୍ ଭିଟ୍ରୋ ଲେବଲ୍ ନିକଟତରତା ଅନୁଧ୍ୟାନ ପାଇଁ, 100 μM ଶୁଦ୍ଧ ମିନିଏସୋଗ୍, 1 ମିଏମ୍ ପ୍ରୋବ 3, ଏବଂ 1 μg ଆଣ୍ଟି-ଲେବଲ୍ ମାଉସ୍ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟିବଡି (ଟ୍ରାନ୍ସଜେନ୍, # HT501-01) କୁ PBS ରେ ସମୁଦାୟ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରିମାଣରେ 50 μl ମିଶ୍ରଣ କରନ୍ତୁ |।ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମିଶ୍ରଣକୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 0, 2, 5, 10, ଏବଂ 20 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ନୀଳ ଏଲଇଡି ଆଲୋକ ସହିତ ବିକିରଣ କରାଯାଇଥିଲା |ଏହି ମିଶ୍ରଣକୁ 0.1 ମିଟର ବାୟୋଟିନ୍- PEG3- ଆଜାଇଡ୍ (ଆଲାଦ୍ଦିନ, # B122225), 1 ମିମି TCEP, 0.1 ମିଟର TBTA ଲିଗାଣ୍ଡ ଏବଂ 1 ମିଟର CuSO4 ସହିତ ଉପର ତାପମାତ୍ରାରେ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |ସ୍ନାପ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରେ, 4x ଲେମଲିର ବଫର୍ କୁ ସିଧାସଳଖ ମିଶ୍ରଣରେ ମିଶାନ୍ତୁ ଏବଂ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 95 ° C ରେ ଫୁଟାନ୍ତୁ |SDS-PAGE ଜେଲରେ ନମୁନାଗୁଡିକ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଷ୍ଟ୍ରେପଟାଭିଡିନ- HRP (1: 1000, ସୋଲାରବିଓ, # SE068) ସହିତ ପାଶ୍ଚାତ୍ୟ ବ୍ଲୋଟିଂ ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |
ସି-ଟର୍ମିନାଲ୍ ଆମିଡେସନ୍ (LHDALDAK-CONH2) ସହିତ ଏକ ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ଧାରଣ କରିଥିବା ସିନ୍ଥେଟିକ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଭିଟ୍ରୋ ଲେବେଲିଂରେ ଥିବା ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଆଧାରିତ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ଏହି ଅନୁସନ୍ଧାନରେ, 100 μM ଶୁଦ୍ଧ ମିନିଏସୋଗ୍, 10 ମିଏମ୍ ପ୍ରୋବ 3 ଏବଂ 2 μg / ମିଲି ସିନ୍ଥେଟିକ୍ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ PBS ରେ ସମୁଦାୟ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପରିମାଣରେ 50 μl ମିଶ୍ରିତ ହୋଇଥିଲା |ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ମିଶ୍ରଣକୁ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ନୀଳ ଏଲଇଡି ଆଲୋକ ସହିତ ବିକିରଣ କରାଯାଇଥିଲା |ଏକ ମାଇକ୍ରୋଲାଇଟର ନମୁନାକୁ ଏକ LC-MS ସିଷ୍ଟମ୍ (ୱାଟର୍, SYNAPT XS ଆଇନ୍ସ ମୋବିଲିଟି ଟାଇମ୍ ଅଫ୍ ଫ୍ଲାଇଟ୍ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର ସହିତ MassLynx ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରମ୍ ଆନାଲିସିସ୍ ସଫ୍ଟୱେର୍) ବ୍ୟବହାର କରି ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |
HEK293T କୋଷଗୁଡ଼ିକ ସ୍ଥିର ଭାବରେ ମିନିସୋଗ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଜିନ୍ କୁ 10 ସେମି ଡିସ୍ ରେ ବିଭିନ୍ନ ଅର୍ଗାନେଲ୍ ଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ (ମିଟୋ, ଇଆର୍, ନ୍ୟୁକ୍ଲିଅସ୍) ଏବଂ ପାର୍କିନ୍-ମିନିସୋଗ୍ ଏବଂ BRD4-miniSOG ରେଖା ପାଇଁ 15 ସେମି ଡିସ୍ ରେ ବିହନ କରାଯାଇଥିଲା |~ 90% ମିଳନ ସ୍ଥଳରେ ପହଞ୍ଚିବା ପରେ, କୋଷଗୁଡିକ HBSS ସହିତ ଥରେ ଧୋଇଗଲା, ତାପରେ HBSS ରେ ପ୍ରୋବ 3 ସହିତ 37 ° C ରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଗଲା ଏବଂ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 10 W ନୀଳ ଏଲଇଡି ସହିତ ଆଲୋକିତ ହେଲା |ପାର୍କିନ୍‌ର ଅଣ-ଯୋଗାଯୋଗ ଲେବେଲିଂ ପାଇଁ, 10 µM ପ୍ରୋଟନ୍ କାର୍ବନିଲ୍ ସିଆନାଇଡ୍ ବାହକ ମି-କ୍ଲୋରୋଫେନିଲହାଇଡ୍ରାଜୋନ୍ CCCP (ସୋଲାରବିଓ, # C6700) HBSS ରେ ପ୍ରୋବ 3 ସହିତ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 37 ° C ରେ ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା |ସେଲ୍ ଲାଇସିସ୍, କ୍ଲିକ୍ ରସାୟନ ବିଜ୍ଞାନ, ହ୍ରାସ ଏବଂ ଆଲକାଇଲେସନ୍ ଷ୍ଟେପଗୁଡିକ ଉପରୋକ୍ତ ବର୍ଣ୍ଣନା ସହିତ ସମାନ ଥିଲା, ଏହା ବ୍ୟତୀତ 2 ମିଗ୍ରା ଲାଇସେଟ୍ ଯୋଗ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଫୋଟୋଡେଗ୍ରେଡେବଲ୍ ବାୟୋଟିନ୍ ଆଜାଇଡ୍ ପରିବର୍ତ୍ତେ କ୍ଲିକ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟାରେ ବାୟୋଟିନ୍ PEG3 ଆଜାଇଡ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |ସମୃଦ୍ଧ ହେବା ପରେ, ବିଡିକୁ 3 ମିଲି ମିଟର ପିବିଏସ୍ ସହିତ 0.2% SDS ଧାରଣ କରିଥିବା, 3 ଥର 5 ମିଲି ମିଟର ପିବିଏସ୍ ସହିତ 1 ମି ୟୁରିଆ ଏବଂ 3 ଥର 5 ମି.ଲି.ତା’ପରେ, 2 µg ଟ୍ରାଇପିସିନ୍ 300 µl 25 mM ABC ରେ ମିଶି 1 ମି ୟୁରିଆ ଧାରଣ କରି ରାତାରାତି 37 ° C ରେ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଖଣ୍ଡ କରିଦେଲା |2-3-of ର pH ପହଞ୍ଚିବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ଫର୍ମିକ୍ ଏସିଡ୍ ମିଶାଇ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ବନ୍ଦ ହୋଇଗଲା |ବିଡିରେ ଟ୍ରାଇପିସିନାଇଜେସନ୍ ପରେ, ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ସଲ୍ୟୁସନ୍ ଏକ SOLAµ HRP ସ୍ତମ୍ଭ (ଥର୍ମୋ, # 60209-001) ବ୍ୟବହାର କରି ନିଷ୍କାସିତ ହୋଇ ସ୍ପିଡଭ୍ୟାକ୍ ଭ୍ୟାକ୍ୟୁମ୍ ଏକାଗ୍ରତାରେ ଶୁଖିଗଲା |0.1% ଫର୍ମିକ୍ ଏସିଡ୍ ରେ ପେପ୍ଟାଇଡସ୍ ପୁନ red ସମାଧାନ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ ନାନୋ- ESI ଉତ୍ସ ସହିତ ସଜ୍ଜିତ ଏକ ଅର୍ବିଟ୍ରାପ୍ ଫ୍ୟୁଜନ୍ ଲୁମୋସ୍ ଟ୍ରିବ୍ରିଡ୍ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର ବ୍ୟବହାର କରି 500 ng ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |ବାଣିଜ୍ୟିକ RP-HPLC ପୂର୍ବାବଲୋକନ (75 μm x 2 ସେମି) (ଥର୍ମୋ, ନଂ 164946) ଏବଂ ଆନାଲିଟିକାଲ୍ RP-HPLC ସ୍ତମ୍ଭ (75 μm x 25 ସେମି) (ଥର୍ମୋ, ନଂ 164941) ରେ ପେପ୍ଟାଇଡ୍ ଅଲଗା କରାଯାଇଥିଲା, ଉଭୟ 2 μm ରେ ପରିପୂର୍ଣ୍ଣ |60 ମିନିଟରେ 8% ରୁ 35% ACN ଗ୍ରେଡିଏଣ୍ଟ୍, ତାପରେ 300 Nl / ମିନିଟ୍ ର ପ୍ରବାହ ହାରରେ 6 ମିନିଟରେ 98% B କୁ ବୃଦ୍ଧି ପାଇଲା |MS ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରା (350-1500 ମି / z) ରେଜୋଲୁସନ 60,000, AGC 4 × 105 ଏବଂ ସର୍ବାଧିକ ଇନପୁଟ୍ ସମୟ 50 ମି।ମନୋନୀତ ଆୟନଗୁଡିକ HCD ଦ୍ 3 ାରା 3 s ଚକ୍ରରେ ସ୍ normal ାଭାବିକ ଧକ୍କା ଶକ୍ତି 30%, ଏକ ଚତୁର୍ଦ୍ଦଶ ବିଚ୍ଛିନ୍ନତା ୱିଣ୍ଡୋ 1.6 m / z ଏବଂ ରେଜୋଲୁସନ 15000 ସହିତ ଖଣ୍ଡବିଖଣ୍ଡିତ ହୋଇଥିଲା | ଏକ 5 × 104 ଟାଣ୍ଡେମ୍ ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମିଟର AGC ଲକ୍ଷ୍ୟ ଏବଂ ସର୍ବାଧିକ ଇଞ୍ଜେକ୍ସନ୍ ସମୟ | 22 ms ର ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |ଗତିଶୀଳ ବହିଷ୍କାର 45 ସେକେଣ୍ଡରେ ସେଟ୍ ହୋଇଛି | ଅଣସଂରକ୍ଷିତ ଆୟନ କିମ୍ବା 1+ ଏବଂ> 7+ ଚାର୍ଜ ଥିବା ବ୍ୟକ୍ତିମାନେ MS / MS ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟାଖ୍ୟାନ ହୋଇଥିଲେ | ଅଣସଂରକ୍ଷିତ ଆୟନ କିମ୍ବା 1+ ଏବଂ> 7+ ଚାର୍ଜ ଥିବା ବ୍ୟକ୍ତିମାନେ MS / MS ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟାଖ୍ୟାନ ହୋଇଥିଲେ | Неназначенные ионы или ион с сярядом 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС। 1+ ଏବଂ> 7+ ଚାର୍ଜ ସହିତ ଅଣସଂରକ୍ଷିତ ଆୟନ କିମ୍ବା ଆୟନଗୁଡିକ MS / MS ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟାଖ୍ୟାନ କରାଯାଇଥିଲା |+ 指定 的 离子 或 + + 1+ 和> 7+ 的 离子 被 用于 MS / MS。+ 指定 的 离子 或 + + 1+ 和> 7+ 的 离子 被 用于 MS / MS。 Нукаканные ионы или ион с сарядами 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС। 1+ ଏବଂ> 7+ ଚାର୍ଜ ସହିତ ଅଜ୍ଞାତ ଆୟନ କିମ୍ବା ଆୟନଗୁଡିକ MS / MS ପାଇଁ ପ୍ରତ୍ୟାଖ୍ୟାନ କରାଯାଇଥିଲା |
NeutrAvidin ବିଡ୍ ସମୃଦ୍ଧ ହେବା ପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ନମୁନା ପ୍ରସ୍ତୁତି ପଦକ୍ଷେପଗୁଡ଼ିକ ଉପରେ ବର୍ଣ୍ଣିତ LC-MS / MS ବିଶ୍ଳେଷଣ ପରି ସମାନ ଥିଲା |ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଲୋଡିଂ ପାଇଁ ପ୍ରାୟ 50 μg ଲାଇସେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ କ୍ଲିକ୍ ପ୍ରତିକ୍ରିୟା ପାଇଁ 2 ମିଗ୍ରା ଲାଇସେଟ୍ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |ନିଉଟ୍ରାଭିଡିନ ସହିତ ସମୃଦ୍ଧ ଏବଂ ଧୋଇବା ପରେ, ବନ୍ଧାଯାଇଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ଗୁଡିକ ଆଗାରୋଜ୍ ରଜନୀ ବିଡିରେ 50 μl ଲେମଲି ବଫର୍ ମିଶାଇ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 95 ° C ରେ ଫୁଟାଇଲେ |କଣ୍ଟ୍ରୋଲ୍ ଲୋଡ୍ ଇନପୁଟ୍ ଏବଂ ବିଡ୍ ସମୃଦ୍ଧ ନମୁନାଗୁଡିକ SDS-PAGE ଦ୍ୱାରା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ମାନକ ପାଶ୍ଚାତ୍ୟ ବ୍ଲଟ୍ ପଦ୍ଧତି ଦ୍ P ାରା PVDF br ୁଲା (ମିଲିପୋର, # ISEQ00010) କୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା |%। %% ସ୍କିମ୍ କ୍ଷୀର (ସାଙ୍ଗନ୍, # A600669) ସହିତ TBS ରେ 0.1% tween-20 (TBST) ଧାରଣ କରି ମେମ୍ବ୍ରାନଗୁଡିକ ଅବରୋଧ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପ୍ରାଥମିକ ଏବଂ ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ କ୍ରମାଗତ ଭାବରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡିଗୁଡିକ TBST ରେ 5% ସ୍କିମ୍ କ୍ଷୀରରେ 1: 1000 କୁ ମିଶ୍ରିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ରାତିସାରା 4 ° C ରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ସେକେଣ୍ଡାରୀ ଆଣ୍ଟିବଡିଗୁଡିକ 1: 5000 ଅନୁପାତରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନ୍କ୍ୟୁବେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା |କେମିଡୋକ ଏମପି ଇମେଜିଙ୍ଗ ସିଷ୍ଟମ ବ୍ୟବହାର କରି କେମିଲୁମାଇନ୍ସେନ୍ସ ଦ୍ୱାରା ଏହି br ୁଲା ଗୁଡିକ ଭିଜୁଆଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ଚିତ୍ରରେ ଥିବା ବ୍ଲଟ୍ ଏବଂ ଜେଲଗୁଡିକର ସମସ୍ତ ଅଣ ସ୍କାନ୍ କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ଭାବରେ ଉପସ୍ଥାପିତ ହୋଇଛି |
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ବ୍ୟବହୃତ ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡିରେ ରାବଣ ଆଣ୍ଟି- SFPQ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟିବଡି (CST, ନଂ। ଆପ୍), ରାବଣ ଆଣ୍ଟି- mSin3A ପଲିକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟିବଡି (ଆବକାମ, # ab3479), ମାଉସ୍ ଆଣ୍ଟି ଟ୍ୟାଗ୍ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟିବଡି (ଟ୍ରାନ୍ସଜେନ୍, # HT201-02), ମାଉସ୍ ଆଣ୍ଟି-ଆକ୍ଟିନ୍ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟିବଡି (ଟ୍ରାନ୍ସଜେନ୍, # HC201-01), ରାବଣ ଆଣ୍ଟି -CDK2 ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟିବଡି (ABclonal, # A0094), CTBP1 (ABclonal, # A11600) ରୁ ରାବଣ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟିବଡି, DUT (ABclonal, # A2901), ରାବଣ ପଲିକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟିବଡି PSMC4 (ABclonal, # A2505), ରାବଣ ଆଣ୍ଟି- DNAJB1 ପଲିକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟିବଡି (ABclonal, # A5504) |ଏହି ଆଣ୍ଟିବଡିଗୁଡିକ TBST ରେ 5% ସ୍କିମ୍ କ୍ଷୀରରେ 1: 1000 ମିଶ୍ରଣରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ବ୍ୟବହୃତ ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡିଗୁଡିକ 1: 5000 ମିଶ୍ରଣରେ ଆଣ୍ଟି-ରାବଟ୍ ଆଇଜି (ଟ୍ରାନ୍ସଜେନ୍, # HS101-01), ଆଣ୍ଟି-ମାଉସ୍ ଆଇଜି (ଟ୍ରାନ୍ସଜେନ୍, # HS201-01) ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରିଥିଲା ​​|
BRD4 SFPQ ସହିତ ଯୋଗାଯୋଗ କରେ କି ନାହିଁ, ଅଧିକ ଅନୁସନ୍ଧାନ କରିବା ପାଇଁ, ସ୍ଥିର HEK293T ଏବଂ BRD4-miniSOG କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଅତ୍ୟଧିକ ସଙ୍କୋଚନ HEK293T କୁ ​​10 ସେମି ପାତ୍ରରେ ରଖାଯାଇଥିଲା |କୋଷଗୁଡିକ ଥଣ୍ଡା ପିବିଏସ୍ ସହିତ ଧୋଇ ଦିଆଗଲା ଏବଂ 1 ମିଲି ପିଆରସ୍ ଆଇପି ଲାଇସିସ୍ ବଫର୍ (ଥର୍ମୋ ଫିସର, # 87787) ରେ EDTA ମୁକ୍ତ ପ୍ରୋଟେଜ୍ ଇନହିବିଟର ସହିତ 4 ° C ରେ 30 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ ଲାଇସେଡ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ଏହା ପରେ, ଲାଇସେଟ୍ ଗୁଡିକ 1.5 ମିଲି ସେଣ୍ଟ୍ରିଫ୍ୟୁଜ୍ ଟ୍ୟୁବରେ ସଂଗ୍ରହ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ 4 ° C ରେ 10 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 15,871 xg ରେ ସେଣ୍ଟ୍ରିଫୁଗ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ଅଲ ern କିକ ଶକ୍ତି ଅମଳ କରାଯାଇ 5 µg ଆଣ୍ଟି- V5 ନାମକ ମାଉସ୍ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ ଆଣ୍ଟିବଡି (CST, # 80076) ସହିତ ରାତାରାତି 4 ° C ରେ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା |ପାଖାପାଖି 50 µl ପ୍ରୋଟିନ୍ A / G ଚୁମ୍ବକୀୟ ବିଡି (MCE, # HY-K0202) କୁ PBS ସହିତ 0.5% Tween-20 ଧାରଣ କରି ଦୁଇଥର ଧୋଇ ଦିଅନ୍ତୁ |ତାପରେ ସେଲ୍ ଲାଇସେଟ୍ସ ଚୁମ୍ବକୀୟ ବିଡ୍ ସହିତ 4 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ 4 ° C ରେ ତଳରୁ ଉପରକୁ ଘୂର୍ଣ୍ଣନ କରାଯାଇଥିଲା |ତା’ପରେ ବିଡିଗୁଡିକ 1 ମିଲି PBST ବଫର୍ ସହିତ ଚାରିଥର ଧୋଇ 5 ମିନିଟ୍ ପାଇଁ 95 ° C ରେ ଫୁଟାଗଲା |SDS-PAGE ଜେଲ ଉପରେ ନମୁନା ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ମାନକ ପାଶ୍ଚାତ୍ୟ ବ୍ଲଟ୍ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରି PVDF br ାଞ୍ଚାକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରିତ କରାଯାଇଥିଲା |TBST ରେ 5% ସ୍କିମ୍ କ୍ଷୀରରେ ଏହି br ୁଲା ଗୁଡିକ ଅବରୋଧ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପ୍ରାଥମିକ ଏବଂ ଦ୍ secondary ିତୀୟ ଆଣ୍ଟିବଡି ସହିତ କ୍ରମାଗତ ଭାବରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରାଥମିକ ଆଣ୍ଟିବଡି ରାବଟ୍ ଆଣ୍ଟି- SFPQ ମୋନୋକ୍ଲୋନାଲ୍ ଆଣ୍ଟିବଡି (CST, # 71992) TBST ରେ 5% ସ୍କିମ୍ କ୍ଷୀରରେ 1: 1000 ଅନୁପାତରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ ରାତିସାରା 4 ° C ରେ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଯାଇଥିଲା |ଆଣ୍ଟି-ରାବଟ୍ ଆଇଜି 1: 5000 ଅନୁପାତରେ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା ଏବଂ କୋଠରୀ ତାପମାତ୍ରାରେ 1 ଘଣ୍ଟା ପାଇଁ ଇନ୍କ୍ୟୁବ୍ କରାଯାଇଥିଲା |କେମିଡୋକ ଏମପି ଇମେଜିଙ୍ଗ ସିଷ୍ଟମ ବ୍ୟବହାର କରି କେମିଲୁମାଇନ୍ସେନ୍ସ ଦ୍ୱାରା ଏହି br ୁଲା ଗୁଡିକ ଭିଜୁଆଲ୍ କରାଯାଇଥିଲା |
ସଲଭେଣ୍ଟ ଆକ୍ସେସିବଲ୍ ସର୍ଫେସ୍ ଏରିଆ (SASA) ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ବ୍ୟବହୃତ ସମସ୍ତ ସଂରଚନା ପ୍ରୋଟିନ୍ ଡାଟା ବ୍ୟାଙ୍କ (PDB) 52 କିମ୍ବା ଆଲଫାଫୋଲ୍ଡ ପ୍ରୋଟିନ୍ ସଂରଚନା ଡାଟାବେସ୍ 53 ରୁ ପ୍ରାପ୍ତ ହୋଇଥିଲା |FreeSASA ପ୍ରୋଗ୍ରାମ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରତ୍ୟେକ ଅବଶିଷ୍ଟ ପାଇଁ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ SASA ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ପ୍ରତ୍ୟେକ ସଂରଚନା ପାଇଁ ହାରାହାରି SASA ପାଇବା ପାଇଁ କେବଳ ଲେବଲ୍ ହୋଇଥିବା ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ଏବଂ ଏହାର ପଡ଼ୋଶୀମାନଙ୍କ ପାଇଁ କେବଳ ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ ଏବଂ ଅସ୍ପଷ୍ଟ SASA ତଥ୍ୟ ବ୍ୟବହୃତ ହୋଇଥିଲା |ପ୍ରତ୍ୟେକ ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ପାଇଁ ଆପେକ୍ଷିକ ଦ୍ରବଣକାରୀ ଆକ୍ସେସିବିଲିଟି (RSA) ଦ୍ରବଣରେ ଉପଲବ୍ଧ ସାମ୍ରାଜ୍ୟର ସର୍ବାଧିକ ସମ୍ଭାବ୍ୟ ଅବଶିଷ୍ଟ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ଦ୍ୱାରା ସଂପୂର୍ଣ୍ଣ SASA ମୂଲ୍ୟକୁ ବିଭକ୍ତ କରି ଗଣନା କରାଯାଇଥିଲା |ସମସ୍ତ ହିଷ୍ଟିଡାଇନ୍ ଗୁଡିକ ଲୁକ୍କାୟିତ ଭାବରେ ଶ୍ରେଣୀଭୁକ୍ତ କରାଗଲା ଯଦି ହାରାହାରି RSA 20% ତଳେ ଥାଏ, ଅନ୍ୟଥା ଉନ୍ମୋଚିତ 56 |
DDA ମୋଡରେ ପ୍ରାପ୍ତ କଞ୍ଚା ଫାଇଲଗୁଡିକ ସାଧାରଣ ପ୍ରଦୂଷକ ଧାରଣ କରିଥିବା ଉପଯୁକ୍ତ ସ୍ୱିସ୍ ପ୍ରୋଟ ଯାଞ୍ଚ ହୋଇଥିବା ପ୍ରୋଟିନ୍ ଡାଟାବେସରେ ପ୍ରୋଟିମ୍ ଆବିଷ୍କାରକ (v2.5) କିମ୍ବା MSfragger (Fragpipe v15.0) ବ୍ୟବହାର କରି ଖୋଜା ଯାଇଥିଲା |ପେପ୍ଟାଇଡସ୍ ଦୁଇଟି ନିଖୋଜ କ୍ଲିଭେଜ୍ ସାଇଟ୍, କାର୍ବାମୋଏଲ୍ ମିଥାଇଲେସନ୍ ସହିତ ଏକ ସ୍ଥିର ରୂପାନ୍ତର ଏବଂ ମିଥୋନିନ୍ ଅକ୍ସିଡେସନ୍ ସହିତ ଗତିଶୀଳ ଟ୍ରାଇପିସିନ୍ ଆବଶ୍ୟକ କରେ |ପୂର୍ବ ଏବଂ ଖଣ୍ଡ ଖଣ୍ଡ ସହନଶୀଳତା ଯଥାକ୍ରମେ 10 ppm ଏବଂ 0.02 Da (MS2 Orbitrap) ରେ ସେଟ୍ କରାଯାଇଥିଲା | ପ୍ରଦୂଷକ ହିଟ୍ ଅପସାରଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ <1% ମିଥ୍ୟା ଆବିଷ୍କାର ହାର ପାଇବା ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଫିଲ୍ଟର୍ କରାଯାଇଥିଲା | ପ୍ରଦୂଷକ ହିଟ୍ ଅପସାରଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ <1% ମିଥ୍ୟା ଆବିଷ୍କାର ହାର ପାଇବା ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଫିଲ୍ଟର୍ କରାଯାଇଥିଲା | Попадания загрязняющих веществ былы удалены, а белки отфиль чвваня, ч чы получить коэффентент ложного обнаружения <1% ପ୍ରଦୂଷଣକାରୀ ହିଟ୍ ଅପସାରଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ମିଥ୍ୟା ଚିହ୍ନଟ ହାର <1% ଦେବା ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଫିଲ୍ଟର୍ କରାଯାଇଥିଲା |去除 污染物 命中 ， 1 1 获得 <1% 的 错误 发现 率。 <1% 的 错误 发现 率。 Попадания загрязняющих веществ былы удалены, а белки отфиль квваня для достижения оровня ложных обнаружений <1% ପ୍ରଦୂଷକ ହିଟ୍ ଅପସାରଣ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ମିଥ୍ୟା ସକରାତ୍ମକ ହାର <1% ହାସଲ କରିବାକୁ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଫିଲ୍ଟର୍ କରାଯାଇଥିଲା |ଲେବଲ୍ ବ୍ୟବହାର ନକରି ପରିମାଣିକ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ, ତିନୋଟି ଜ ological ବିକ ପୁନରାବୃତ୍ତିରୁ ସ୍ protein ାଭାବିକ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବିଷୟବସ୍ତୁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇଥିଲା |DAVID ବାୟୋନ୍ଫର୍ମାଟିକ୍ସ ରିସୋର୍ସ, ମାଇଟୋକାର୍ଟା .0.୦ ଏବଂ ଆଲିସ୍ ଟିଙ୍ଗ୍ ଗ୍ରୁପ୍ ଦ୍ୱାରା ସଂକଳିତ ଏବଂ ପ୍ରକାଶିତ ଡାଟାବେସ୍ ଜିନ୍ ଅନ୍ଟୋଲୋଜି (GO) ବିଶ୍ଳେଷଣ ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରୋଟିନ୍ ସବସେଲୁଲାର୍ ଲୋକାଲାଇଜେସନ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |ଆଗ୍ନେୟଗିରି ମାନଚିତ୍ର ପେରେସ (v1.6.15.0) ରୁ ମିଳିଥିଲା ​​| ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ t ଟି-ଟେଷ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି ପରିସଂଖ୍ୟାନିକ ମହତ୍ତ୍ୱ ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରଚୁରତା ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡିକ ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ହିଟ୍ ପ୍ରଚୁର ପରିବର୍ତ୍ତନ> 2 (ଅନ୍ୟଥା ଉଲ୍ଲେଖ ନହେଲେ) ଏବଂ p ମୂଲ୍ୟ <0.05 ସହିତ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା | ଦୁଇ-ପାର୍ଶ୍ t ଟି-ଟେଷ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି ପରିସଂଖ୍ୟାନିକ ମହତ୍ତ୍ୱ ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନ୍ ପ୍ରଚୁରତା ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡିକ ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ହିଟ୍ ପ୍ରଚୁର ପରିବର୍ତ୍ତନ> 2 (ଅନ୍ୟଥା ଉଲ୍ଲେଖ ନହେଲେ) ଏବଂ p ମୂଲ୍ୟ <0.05 ସହିତ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା | Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием дву чероннего т-критерия, и совпадения белков былы идентифицирован с изменением содержя> 2 ଦୁଇଟି ଲାଞ୍ଜ ବିଶିଷ୍ଟ ଟି-ଟେଷ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି ପରିସଂଖ୍ୟାନିକ ମହତ୍ତ୍ for ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନ୍ ବିଷୟବସ୍ତୁ ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡିକ ପରୀକ୍ଷା କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମେଳଗୁଡିକ ବିଷୟବସ୍ତୁ ପରିବର୍ତ୍ତନ> 2 (ଅନ୍ୟଥା ଉଲ୍ଲେଖ ନହେଲେ) ଏବଂ ଆପ୍ ମୂଲ୍ୟ <0.05 ସହିତ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିଲା |使用 双边 t 检验 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05> 0.05。使用 双边 t 检验 0.05 0.05 0.05 2 2 2 2 2 2> 2 （另 0.05 0.05 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием дву зононнего т-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания> 2 (если не укакоо ино) ପ୍ରୋଟିନ୍ ବିଷୟବସ୍ତୁରେ ଫୋଲ୍ଡ ପରିବର୍ତ୍ତନଗୁଡ଼ିକର ପରିସଂଖ୍ୟାନିକ ମହତ୍ତ୍ two ଦୁଇଟି ଲାଞ୍ଜ ବିଶିଷ୍ଟ ଟି-ଟେଷ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି ପରୀକ୍ଷଣ କରାଯାଇଥିଲା, ଏବଂ ବିଷୟବସ୍ତୁ ପରିବର୍ତ୍ତନ> 2 (ଅନ୍ୟଥା ସୂଚିତ ନହେଲେ) ଏବଂ p- ମୂଲ୍ୟ <0.05 ପାଇଁ ପ୍ରୋଟିନ୍ ମେଳ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |ଷ୍ଟ୍ରିଙ୍ଗ୍ ଡାଟାବେସ୍ ସହିତ GO ବିଶ୍ଳେଷଣ ବ୍ୟବହାର କରି ପ୍ରୋଟିନ୍ ପାରସ୍ପରିକ ବିଶ୍ଳେଷଣ କରାଯାଇଥିଲା |
ସମାନ ଫଳାଫଳ ସହିତ ତିନୋଟି ଜ bi ବିକ ପ୍ରତିକୃତି କରାଯାଇଥିଲା |ପରିସଂଖ୍ୟାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ଗ୍ରାଫପ୍ୟାଡ ପ୍ରିଜିମ (ଗ୍ରାଫପ୍ୟାଡ ସଫ୍ଟୱେୟାର) ସହିତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ପେରେସ (v1.6.15.0) ସହିତ ଆଗ୍ନେୟଗିରି ପ୍ଲଟ ସୃଷ୍ଟି କରାଯାଇଥିଲା |ଦୁଇଟି ଗୋଷ୍ଠୀକୁ ତୁଳନା କରିବା ପାଇଁ, ଦୁଇ-ଲାଞ୍ଜର ଛାତ୍ରଙ୍କ ଟି-ଟେଷ୍ଟ ବ୍ୟବହାର କରି p- ମୂଲ୍ୟ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରାଯାଇଥିଲା |ପରୀକ୍ଷାମୂଳକ ଗୋଷ୍ଠୀରେ ଅତି କମରେ ଦୁଇଥର ଚିହ୍ନିତ ସିଙ୍ଗଲେଟନ୍ ପ୍ରୋଟିନ୍ ଆଗ୍ନେୟଗିରି ପ୍ଲଟରେ ଅନ୍ତର୍ଭୂକ୍ତ କରାଯାଇଥିଲା ଏବଂ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ଗୋଷ୍ଠୀର ଅନୁପସ୍ଥିତ ମୂଲ୍ୟଗୁଡିକ ସାଧାରଣ ବଣ୍ଟନରୁ ପେରେସ୍ ସହିତ ବଦଳାଯାଇଥିଲା ଯାହା ଦ୍ p ାରା p- ମୂଲ୍ୟ ଗଣନା କରାଯାଇପାରିବ |ତ୍ରୁଟି ଦଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକ ହାରାହାରି ± ମାନକ ବିଘ୍ନକୁ ପ୍ରତିନିଧିତ୍ୱ କରେ |ପରିସଂଖ୍ୟାନ ବିଶ୍ଳେଷଣ ପାଇଁ ପ୍ରୋଟୋମିକ୍ ବିଶ୍ଳେଷଣରେ, ଅତି କମରେ ଦୁଇଟି ଜ ological ବିକ ପ୍ରତିକୃତିରେ ଦେଖାଯାଉଥିବା ପ୍ରୋଟିନର ପ୍ରଚୁରତା ବଜାୟ ରହିଲା |ନମୁନା ଆକାରକୁ ପୂର୍ବ ନିର୍ଣ୍ଣୟ କରିବା ପାଇଁ ପରିସଂଖ୍ୟାନ ପଦ୍ଧତି ବ୍ୟବହାର କରାଯାଇନଥିଲା |ପରୀକ୍ଷଣଗୁଡିକ ଅନିୟମିତ ନୁହେଁ |ଅନୁସନ୍ଧାନକାରୀମାନେ ଫଳାଫଳ ଏବଂ ମୂଲ୍ୟାଙ୍କନ ସମୟରେ କାର୍ଯ୍ୟଗୁଡିକ ପାଇଁ ଅନ୍ଧ ନଥିଲେ |
ଅଧ୍ୟୟନ ଡିଜାଇନ୍ ବିଷୟରେ ଅଧିକ ସୂଚନା ପାଇଁ, ଏହି ଆର୍ଟିକିଲ୍ ସହିତ ଲିଙ୍କ୍ ହୋଇଥିବା ପ୍ରକୃତି ଅନୁସନ୍ଧାନ ରିପୋର୍ଟର ଅବକ୍ଷୟ ଦେଖନ୍ତୁ |
ଏହି ଅଧ୍ୟୟନରେ ମିଳିଥିବା ମାସ ସ୍ପେକ୍ଟ୍ରୋମେଟ୍ରି ତଥ୍ୟ, ଡାଟାସେଟ ID PXD034811 (PDPL-MS ଡାଟାସେଟ) ଅନ୍ତର୍ଗତ iProX57 ସହଭାଗୀ ସଂଗ୍ରହାଳୟ ମାଧ୍ୟମରେ ପ୍ରୋଟୋମ ଏକ୍ସଚେଞ୍ଜ କନ୍ସୋର୍ଟିୟମକୁ ଦାଖଲ କରାଯାଇଥିଲା |କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ଫାଇଲ ଆକାରରେ କଞ୍ଚା ତଥ୍ୟ ପ୍ରଦାନ କରାଯାଇଛି |ଏହି ଆର୍ଟିକିଲ୍ ମୂଳ ତଥ୍ୟ ପ୍ରଦାନ କରେ |
ଜିଙ୍ଗ୍ରାସ୍, ଏସି, ଆବେ, କେଟି ଏବଂ ରଗ୍, ବି ଆଖପାଖ ବିଷୟରେ ଜାଣିବା: ପ୍ରୋଟିନ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ ଏବଂ ମାନଚିତ୍ର ଅର୍ଗାନେଲ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବା ପାଇଁ ନିକଟତର-ନିର୍ଭରଶୀଳ ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ୍ ବ୍ୟବହାର | ଜିଙ୍ଗ୍ରାସ୍, ଏସି, ଆବେ, କେଟି ଏବଂ ରଗ୍, ବି ଆଖପାଖ ବିଷୟରେ ଜାଣିବା: ପ୍ରୋଟିନ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ ଏବଂ ମାନଚିତ୍ର ଅର୍ଗାନେଲ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବା ପାଇଁ ନିକଟତର-ନିର୍ଭରଶୀଳ ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ୍ ବ୍ୟବହାର |ଜିଙ୍ଗ୍ରାସ, ଏସ୍, ଆବେ, କେଟି ଏବଂ ରାଉତ, ବି ପରିବେଶ ସହିତ ପରିଚିତତା: ପ୍ରୋଟିନ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସ ଏବଂ ମାନଚିତ୍ର ଅର୍ଗାନେଲ୍ଗୁଡ଼ିକୁ ବର୍ଣ୍ଣିତ କରିବା ପାଇଁ ନିକଟତର-ନିର୍ଭରଶୀଳ ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ୍ ବ୍ୟବହାର | ଜିଙ୍ଗ୍ରାସ୍, ଏସି, ଆବେ, କେଟି ଏବଂ ରଗ୍, ବି 了解 邻里 ： 使用。。。。。。 ଜିଙ୍ଗ୍ରାସ୍, ଏସି, ଆବେ, କେଟି ଏବଂ ରଥ, ବି ପଡ଼ୋଶୀକୁ ବୁ standing ିବା: ଜ ological ବ ଜୀବନ ଉପରେ ପଡ଼ୋଶୀଙ୍କ ନିର୍ଭରଶୀଳତାକୁ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ |ଜିଙ୍ଗ୍ରାସ, ଏସ୍, ଆବେ, କେଟି ଏବଂ ରାଉତ, ବି ନିକଟତରତାକୁ ବୁ: ିବା: ପ୍ରୋଟିନ୍ କମ୍ପ୍ଲେକ୍ସଗୁଡିକର ଚରିତ୍ରକରଣ ଏବଂ ନିକଟତର-ନିର୍ଭରଶୀଳ ବାୟୋଟିନାଇଲେସନ୍ ବ୍ୟବହାର କରି ଅର୍ଗାନେଲ୍ସର ମ୍ୟାପିଙ୍ଗ୍ |ସାମ୍ପ୍ରତିକମୋର ମତରାସାୟନିକଜୀବବିଜ୍ଞାନ 48, 44–54 (2019) |
ଗେରି, ଜେବି ଇତ୍ୟାଦି |ପ୍ରତିରକ୍ଷା କୋଷକୁ ଡେକ୍ସଟର୍ ଶକ୍ତି ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରି ମାଇକ୍ରୋ ପରିବେଶକୁ ମ୍ୟାପିଙ୍ଗ୍ |ବିଜ୍ଞାନ 367, 1091-1097 (2020) |
ହର୍ଟଲିଂ, ଏଲ୍ ଏଲ୍।ଦୁଇ-ପ୍ରୋଟିମ୍ ସ୍କେଲ୍ ନେଟୱାର୍କ ମାନବ ଇଣ୍ଟରାକ୍ଟୋମର କୋଷ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ପୁନ od ନିର୍ମାଣକୁ ଚିହ୍ନଟ କରେ |କକ୍ଷଗୁଡିକ 184, 3022–3040.e3028 (2021) |